连缀转录分析实验

离心机和转头，沸腾的水浴锅， Dounce 匀浆器，晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管，聚丙烯管，刀片，预设到 30°C 的振荡水浴，预设到 4°C 和 65°C 的水浴

非重组质粒载体 含感兴趣 cDNA 或基因的重组质粒 培养细胞或新鲜组织
氯仿 DNA变性溶液 乙醇 甘油 贮存缓冲液 HSB缓冲液 标记缓冲液 LiCl 裂解缓冲液 NaCl NaOH Nonidet P-40 细胞核洗涤缓冲液 酚磷酸盐缓冲液 预杂交液 杂交液 反应缓冲液 RNasin SDS 终止缓冲液 组织匀浆缓冲液 台盼蓝染料 DNA 酶溶液 蛋白酶 K 限制性酶 放射性化合物
离心机和转头 沸腾的水浴锅 Dounce 匀浆器 晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管 聚丙烯管 刀片 预设到 30°C 的振荡水浴 预设到 4°C 和 65°C 的水浴

材料
重要：所有试管和溶液都必须不含RNA酶。

缓冲液和溶液

贮存液，缓冲液和试剂的组分请见附录1。
贮存液稀释到适当浓度。

氯仿
氯仿：异戊醇

DNA变性溶液
2mol/L NaCl
0.lmol/L NaOH

乙醇

甘油贮存缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.3)
5 mmol/L MgCl₂
0.1 mmol/L EDTA(pH8.0)
40%(V/V)甘油
缓冲液贮存在 4°C

HSB缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(pH7.4)
50 mmol/L MgCl₂
2 mmol/L CaCl₂
0.5mol/L NaCl
缓冲液贮存在室温。

标记缓冲液
20 mmol/LTris-Cl(4°C 时 pH8.0)
140 mmol/L KCl
10 mmol/L MgCl₂
1 mmol/L MoCl₂
20%(V/V>甘油
14 mmol/L β-琉基乙醇
各 1 mmol/L ATP、GTP 和 CTP
10 mmol/L 磷酸肌氨酸
100ug/ml 磷酸肌氨酸激酶
0.1umol/L[³²P]UTP，500~5000uCi/ml
最后 5 种组分在临用前加入，溶液保存在 4°C。放射性 UTP 加入后需要特规保护。

LiCl(5mol/L)

裂解缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(4°C 时 pH8.4)
1.5 mmol/L MgCl₂
0.14mol/L NaCl
缓冲液贮存在4°C。

NaCl(2mol/L)

NaOH(0.1mol/L)

Nonidet P-40(5% V/V)

细胞核洗涤缓冲液
20 mmol/L Tris-Cl(4°C时pH8.0)
140 mmol/L KCl
10 mmol/L MgCl₂
1 mmol/L MoCl₂
20%(v/v) 甘油
14 mmol/Lβ-巯基乙醇
缓冲液贮存在 4°C。临用前，把β-琉基乙醇浓缩贮存液加到缓冲液中。

酚

磷酸盐缓冲液（PBS)

预杂交液/杂交液
核连缀实验中一般用含甲酰胺的杂交缓冲液，如 50%(V/V) 甲酰胺，6XSSC，5 mmol/L 焦磷酸钠，2XDenhardt 溶液，0.5%(m/V)SDS，10ug/ml poly(A)，100ug/ml 鲑鱼精 DNA。

2X 反应缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
5 mmol/L MgCl₂
0.3 ml/L KCl
缓冲液贮存在 4°C。临用前在 1 ml 2x 反应缓冲液中加入 5ul 1mol/L DTT，100ul 100 mmol/L ATP，10ul 100 mmol/L CTP 和 10ul 100 mmol/L GTP。

RNasin
RNasin 是大鼠肝脏 RNA 酶抑制剂蛋白的通称。有些公司提供这种酶制品。

SDS(0.5%m/V)
6XSSC

终止缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)
20 mmol/L EDTA(pH8.0)
0.8%(m/V)SDS
缓冲液贮存在室温。

组织匀浆缓冲液
10 mmol/L HEPES-KOH(pH7.6)
25 mmol/L KCl
0.15 mmol/L 精胺
0.5 mmol/L 亚精胺
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
2mol/L 蔗糖
10%(V/V) 甘油
缓冲液贮存在 4°C。步骤 1 临用前，加入 CTT 使终浓度为 1 mmol/L，并加入蛋白酶抑制剂(0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟，1ug/ml 亮抑酶肽，1ug/ml 抑胃酶肽，或者加入其他所需试剂）。

台盼蓝染料（0.4%m/V)
取一定置染料溶于不含 Ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液（PBS）中。室温贮存。

酶和缓冲液

DNA 酶溶液
在 1 ml 0.0025mol/L HCl 和 50%(V/V) 甘油中溶解 2 mg 不含 RNA 酶的 DNA 酶 (如 Worthington 公司)。溶液贮存在-20°C。

蛋白酶 K(可选）

限制性酶
请见步骤 9。

放射性化合物
[α-³²P]UTP(500~5000uCi/ml)
每个核酸样品用 100uCi 进行放射标记。

离心机和转头
Beckman SW28 转头或类似产品
Sorvall H1000B 转头或类似产品
Sorvall SS-34 转头或类似产品
重要：所有转头预冷到 4°C

特殊设备
沸腾的水浴锅
带 B 型研杵的 Dounce 匀浆器
晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管
聚丙烯管（17 mmx100 mm)
刀片
预设到 30°C 的振荡水浴
预设到 4°C 和 65°C 的水浴

辅助试剂
本方案步骤 11 需要列在第 7 章方案 9 中的试剂和设备。
本方案步骤 13 需要列在第 6 章方案 8 中的试剂。
本方案步骤 14~16 需要列在第 6 章方案 8 和 10 中的试剂。

载体和菌株
非重组质粒载体
含感兴趣 cDNA 或基因的重组质粒

细胞和组织
培养细胞或新鲜组织

方法

核酸分离和 RNA 转录物放射标记

1. 从培养的细胞或新鲜组织中分离核酸。

从培养的细胞中分离核酸
a. 从培养皿中刮下细胞，用冰冷的 PBS 洗两次。在聚丙烯管（17 mmXl00 mm) 中，用 1 ml 冰冷的裂解缓冲液重悬 1x10⁷ 到 1X10⁸ 细咆。加 2~4ul 5%NonidetP-40, 悬液冰浴 10 min。

b.10ul 悬液和等体积 0.4% 台盼蓝染料混合，在装有 20x 物镜的显微镜下检测溶液。裂解的细胞吸收染料显蓝色，未裂解的细胞由于染料不能透过而仍然透明。继续加入 2ul 5%NonidetP-40, 观察细胞裂解情况直至大于 80% 的细胞裂解。

c. 用台式离心机以 1300 g(Sorvall Hl000B 转头 2500r/min) 离心 1 min 回收核酸。去掉上清。核酸沉淀用 lml 核酸洗涤缓冲液洗两次。进行步骤 2。

从组织中分离梭酸
a. 解剖 10~15 g 组织并切碎。用冰冷的组织匀浆缓冲液调整切碎组织的体积到 30ml, 在紧型 Dounce 匀浆器中匀浆。

b. 为了检测裂解情况，10ul 细胞悬液和等体积 0.4% 台盼蓝染料混合，在装有 20X物镜的显微镜下检察溶液。裂解的细胞吸收染料显蓝色，未裂解的细胞由于染料不能透过而仍然透明。继续组织匀浆直至大于 80%~90% 的细胞破裂。

c. 用冰冷的组织匀浆缓冲液稀释匀浆物到 85 ml。在晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管中，10 ml 冰冷的匀浆缓冲液垫层上铺 27 ml 匀浆物。管子在 4°C 以 103900g(Beckman SW28 转头 24000r/min) 离心 40 min

d. 去掉上清，管子倒置 l~2 min。管子放到冰上。用 2 ml 甘油贮存缓冲液上下吹打重悬沉淀物。
(可选）用刀片切掉管子的上部 2/3, 在用甘油贮存缓冲液重悬沉淀物前，把装有核酸的 1/3 底部放在冰上。

e.10ul 核酸悬液与 990ul 0.5%SDS 混合。用紫外分光光度计测 OD₂₆₀， 用甘油贮存缓冲液稀释核酸悬液，使终浓度为 50 OD₂₆₀/ml。用 1.5 ml 离心管把核酸制备物分装成 200ul 的小份，液氮怏速冷冻，贮存在-70°C。进行步骤 2。

2. 在纯化的核酸中对新生 RNA 进行放射标记。

对于从培养的细胞中分离的核酸，放射标记其中的转录物
a. 最后一次洗涤后（步骤1c), 尽可能多地去掉上清，用 50~100ul 标记缓冲液重悬核酸。核酸在 30°C 振荡水浴中孵育 15~20 min。
警吿：放射性 UTP 加到溶液中以后，要极其小心戴手套和眼镜并且注意不要用高放射性溶液等污染台面。

b. 在台式离心机中以 800 g（Sorvall H1000B 转头 1960r/min) 离心 5 min 沉淀核酸，小心去掉上清，以放射性废料处理。进行步骤 3。
如附录 8 所述，可以用三氯乙酸（TCA) 沉淀法检测 [³²P]UTP 掺入 RNA 的情况。对于一次成功的标记反应，如果含有放射标记的 UTP 和 10OD₂₆₀ 核酸，那么 80%~90％³²P 会掺入到可用 TCA 沉淀的物质中。

对于从组织中分离的核酸，放射标记其中的转录物
a. 把适世的细胞核制备物从-70°C 转移到冰桶中。液体溶解后，每管加 400 单位 RNasin。每管核酸中加 200ul 补充有核苷酸和 DTT 的 2X 反应缓冲液。加入 100 uCi[α-³²P]UTP。
警告：放射性 UTP 加到溶液中以后，要极其小心。戴手套和眼镜并且注意不要用高放射性溶液等污染台面。

b. 核酸在 30°C 振荡水浴中孵育 20 min。2000r/min 离心 1~2 min 回收核酸。小心去掉上清，以放射性废料处理。进行步骤 3。
如附录 8 所述，可以用三氯乙酸（TCA) 沉淀法检测 [³²P]UTP 掺入 RNA 的情况。对于一次成功的标记反应，如果有100uCi 放射标记的 UTP 和 10OD₂₆₀ 核酸，那么 80%~90％³²P 会掺入到可用 TCA 沉淀的物质中。

3. 用1ml 冰冷的 HSB 缓冲液重悬细胞核沉淀物，然后加入 10ul DNA 酶溶液。上下吹打核酸直到核酸重悬起来并且溶液的黏滞度下降（1~5 min)。加 2 ml 终止缓冲液。
DNA 酶处理可以减低溶液的黏滞度并防止新生的放射标记 RNA 转录物被基因组 DNA 捕获。黏滞度不会完全消除，也经常会留有核酸团块。

4.(可选）为了提高放射标记 RNA 的产量，在 DNA 酶处理以后，可以加入蛋白酶 K。在加入 2 ml 终止缓冲液后，加入蛋白酶 K 使其终浓度为100ug/ml。溶液在 42°C 孵育 30 min。进行步骤 5。
更大规模的 DNA 去除和放射标记 RNA 纯化的方案请参见 Groudine 等 (1981)。

5. 加 3 ml 酚，混合物在 65°C 孵育 15 min, 在此期间每 5 min 进行振摇。加 3 ml 氯仿/异戊醇，振荡，以 1900 g 离心分离有机相和水相（Sorvall Hl000B 转头 3000r/min)。
再次用 3 ml 氯仿抽提水相，如前离心，并把水相转移到新管中。

6. 加 0.3 ml5mol/L LiCl 和 2.5 倍体积的乙醇，混合均勻。以 12000 g (Sorvall SS-34 转头 10000r/min) 离心 10 min 收集核酸沉淀。

7. 用 0.4 mlH₂O 重悬沉淀物并转移到 1.5 ml 离心管中。加 40ul 5mol/L LiCl 和 2.5 倍体积的乙醇。溶液以最高速离心 10 min。

8. 用 100ul H₂0 重悬沉淀物，在液闪计数器中测量 cpm/ul。

RNA 与固定的 DNA 杂交

9.10ug 含感兴趣 cDNA 或基因的重组质粒 DNA 以及 10ug 空质粒载体用限制性酶线性化，使用的限制性酶切割位点必须在载体序列中存在。

10. 切割后的 DNA 用标准的乙醇沉淀法回收，分别用 20ulDNA 变性溶液重悬沉淀物。DNA 重悬液煮 2 min, 然后每管加入 180ul 6XSSC。

11. 切一片尼龙膜或硝酸纤维素膜，大小适用于点杂交或狭缝杂交的器具。腆用水浸湿, 然后在 6XSSC 中授泡 5~10 min。湿膜夹到杂交器具上，连上真空管并接上抽气泵（请参见第 7 章方案 9)。

12. 变性 DNA 分别从各个隔开的狭缝滤过，用 200ul 6xSSC 洗每个狭缝。

13. 拆掉杂交器具, 使膜风干，然后通过烘烤或紫外线曝光使 DNA 固定在膜上。

14. 膜放在预杂交液中，至少在合适的溫度孵育 16 h(例如，含 50% 甲酰胺的溶剂用 42°C）。

15. 放射标记探针（32P 标记的 RNA 取自步骤 8.2x10⁶~4X10⁶cpm/ml) 直接加到预杂交液中，滤膜再解育 72 h。

16. 用髙严谨性条件洗膜，对 X 射线胶片或磷屏板曝光。通常曝光时间对于 X 射线胶片是 24~72 h, 对于磷屏板是 4~24 h。