材料与仪器
大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3) pET 载体或同类载体 阳性对照质粒
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 IPTG SDS 凝胶加样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 靶基因或 cDNA 片段 NZCYM 琼脂平板 NZCYM 培养基
SorvallGSA 转头或相当的转头 沸水浴
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 IPTG SDS 凝胶加样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 靶基因或 cDNA 片段 NZCYM 琼脂平板 NZCYM 培养基
SorvallGSA 转头或相当的转头 沸水浴
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录1。
贮存液稀释至适当浓度。
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录8。
IPTG(1mol/L)
1XSDS凝胶加样缓冲液
不含DTT的1xSDS加样缓冲液室温保存,1mol/LDTT贮存液现用现加于上述缓冲液。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%)
用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或cDNA片段
培养基
含氨苄(50ug/ml)的 NZCYM 琼脂平板
含氮苄(50ug/ml) 的 NZCYM 培养基
离心机和转头
SorvallGSA 转头或相当的转头
特别配备
沸水浴
补充试剂
本方案步骤 1 需要第 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。
载体和细菌菌株
大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3)
pET 载体或同类载体
此系列载体请査阅 Novagen 公司目录(或网址 www.novagen.com)。
阳性对照质粒(如表达已知大小融合蛋白的 T7 噬菌体载体)
方法
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段,片段 5' 端和 3' 端带有与 T7 噬菌体启动子表达质粒(如 pET 载体;Studier et al.1990) 对应的限制酶位点。
为确定扩增反应没有引入错误突变,应对 PCR 产物进行序列分析。
必要时可在 cDNA/基因的 ATG 上游置入强的核糖体结合位点。
2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接(第 1 章方案 17 或 19)。
3. 连接产物转化大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3)。将转化体铺于含氨苄 (50ug/ml) 的 NZCYM 平板,于 37°C 过夜培养。
空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。
4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体(请参见第 12 章方案 3)。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担,导致形成包涵体。
5. 对照菌和重组菌分别挑取 1~2 个菌落,接入 lml 含氨苄青霉素(50ng/ml) 的 NZCYM 培养液,37°C 培养过夜至饱和。
6. 取 50ul 接入 5 ml 含氨苄青霉素(50ug/ml) 的 NZCYM 培养液,在 50 ml 摇瓶中于 37°C 培养 2 h。
7. 吸出 lml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中,按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。
8. 在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1 mnol/L,20~37°C 继续通气培养。
有些系统的 T7 噬菌体 RNA 聚合酶的表达受热诱导的启动子调控,而不是 IPTG 诱导的启动子。影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。
9. 在诱导的不同时间(如 0.5、1、2 和 3 h) 取 1 ml 样品放于微量离心管中,测定 A550,室温高速离心 1 min。
10. 沉淀悬于100ul lxSDS 凝胶加样缓冲液,100°C 加热 3 min, 室温高速离心 1min, 冰上放置,待全部样品处理完后上样。
11. 样品加热至室温,取 40ug 或相当于 0.15OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
12.8~15V/cm 电泳,至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13. 考马斯亮蓝染色或银染,或免疫印迹,观察表达产物条带(见附录 8)。
未转化的大肠杆菌细胞和转化了空载体的细胞,蛋白带形应该没有区别。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带。
大量表达靶蛋白
14. 挑取重组和对照大肠杆菌菌落分别接入 50 ml 含氨苄(50ug/ml) 的 NZCYM 培养液,在 250 ml 摇瓶中于 37°C 过夜培养。
15. 取 5~50 ml 过夜培养物接入 450~500 ml 含氨苄(50ug/ml) 的 NZCYM 培养液,在 2L 摇瓶中于 37°C 振荡培养至对数中期(A550=0.5~1.0)。
16. 以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳溫度诱导表达靶蛋白。
17. 诱导适当时间后,于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 从转头)离心 15 min 收集细胞,继续后面的纯化方案:
• 如果表达的是 GST 融合蛋白,继续方案 5
• 如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白,继续方案 6
• 如果表达产物带有组氨酸标签,继续方案 7
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录1。
贮存液稀释至适当浓度。
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录8。
IPTG(1mol/L)
1XSDS凝胶加样缓冲液
不含DTT的1xSDS加样缓冲液室温保存,1mol/LDTT贮存液现用现加于上述缓冲液。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%)
用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或cDNA片段
培养基
含氨苄(50ug/ml)的 NZCYM 琼脂平板
含氮苄(50ug/ml) 的 NZCYM 培养基
离心机和转头
SorvallGSA 转头或相当的转头
特别配备
沸水浴
补充试剂
本方案步骤 1 需要第 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。
载体和细菌菌株
大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3)
pET 载体或同类载体
此系列载体请査阅 Novagen 公司目录(或网址 www.novagen.com)。
阳性对照质粒(如表达已知大小融合蛋白的 T7 噬菌体载体)
方法
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段,片段 5' 端和 3' 端带有与 T7 噬菌体启动子表达质粒(如 pET 载体;Studier et al.1990) 对应的限制酶位点。
为确定扩增反应没有引入错误突变,应对 PCR 产物进行序列分析。
必要时可在 cDNA/基因的 ATG 上游置入强的核糖体结合位点。
2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接(第 1 章方案 17 或 19)。
3. 连接产物转化大肠杆菌菌株 HMS174(DE3) 或 BL21(DE3)。将转化体铺于含氨苄 (50ug/ml) 的 NZCYM 平板,于 37°C 过夜培养。
空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。
4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体(请参见第 12 章方案 3)。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担,导致形成包涵体。
5. 对照菌和重组菌分别挑取 1~2 个菌落,接入 lml 含氨苄青霉素(50ng/ml) 的 NZCYM 培养液,37°C 培养过夜至饱和。
6. 取 50ul 接入 5 ml 含氨苄青霉素(50ug/ml) 的 NZCYM 培养液,在 50 ml 摇瓶中于 37°C 培养 2 h。
7. 吸出 lml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中,按下面步骤 9 和 10 所述进行处理。
8. 在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度 1 mnol/L,20~37°C 继续通气培养。
有些系统的 T7 噬菌体 RNA 聚合酶的表达受热诱导的启动子调控,而不是 IPTG 诱导的启动子。影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。
9. 在诱导的不同时间(如 0.5、1、2 和 3 h) 取 1 ml 样品放于微量离心管中,测定 A550,室温高速离心 1 min。
10. 沉淀悬于100ul lxSDS 凝胶加样缓冲液,100°C 加热 3 min, 室温高速离心 1min, 冰上放置,待全部样品处理完后上样。
11. 样品加热至室温,取 40ug 或相当于 0.15OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
12.8~15V/cm 电泳,至溴酚兰迁移到分离胶底部。
13. 考马斯亮蓝染色或银染,或免疫印迹,观察表达产物条带(见附录 8)。
未转化的大肠杆菌细胞和转化了空载体的细胞,蛋白带形应该没有区别。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带。
大量表达靶蛋白
14. 挑取重组和对照大肠杆菌菌落分别接入 50 ml 含氨苄(50ug/ml) 的 NZCYM 培养液,在 250 ml 摇瓶中于 37°C 过夜培养。
15. 取 5~50 ml 过夜培养物接入 450~500 ml 含氨苄(50ug/ml) 的 NZCYM 培养液,在 2L 摇瓶中于 37°C 振荡培养至对数中期(A550=0.5~1.0)。
16. 以预试验确定的最佳 IPTG 浓度、最佳时间和最佳溫度诱导表达靶蛋白。
17. 诱导适当时间后,于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 从转头)离心 15 min 收集细胞,继续后面的纯化方案:
• 如果表达的是 GST 融合蛋白,继续方案 5
• 如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白,继续方案 6
• 如果表达产物带有组氨酸标签,继续方案 7
来源:丁香实验