材料与仪器
ATP 结合缓冲液 变性溶液 二硫苏糖醇 EDTA 乙醇激酶 连接酶缓冲液 酚 氯 仿筛选缓冲液 SDS 醋酸钠 TE T4 噬菌体 DNA 连接酶 T4 噬菌体多核苷酸激酶 合成的寡核苷酸 [a-32P]ATP 非变性聚丙烯酰胺凝胶
烤盘 结晶皿 平头镊子 装有防水黑墨水 注射器 硝酸纤维素滤膜 Sephadex G-75 离心柱 水浴 Whatman 3 MM 滤纸
烤盘 结晶皿 平头镊子 装有防水黑墨水 注射器 硝酸纤维素滤膜 Sephadex G-75 离心柱 水浴 Whatman 3 MM 滤纸
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液, 缓冲液和试剂的组分请见附录 1。
将贮存液稀释到适当的浓度。
ATP(100 mmol/L)
用 25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 稀释 100 mml/L 贮存液分别配制 10 mmol/L 和 50 mmol/L 两种浓度的 ATP 溶液。
10X 结合缓冲液
250 mmol/LHEPES(pH7.9)
30 mmol/LMgCl2
40 mmol/LKCl
含 1 mmol/L 二硫苏糖醇的 lx 结合缓冲液
该溶液用于稀释完全变性溶液以配制本节中一系列的洗液。请参见步骤 11~13 计算所需的溶液体积。
含 1 mmol/L 二硫苏糖醇和 0.25% 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液
用于筛选的每张 82 mm 滤膜需要 1X 结合缓冲液大约 75 ml,138 mm 的滤要 180 ml。淸洗过程中勿减少使用该缓冲液体积。
含 5%(m/V) 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液
用于筛选的每张 82 mm 滤膜需要该封闭液 10 ml 或每张 138 mm 滤膜需要 25 ml。
含 0.25%(m/V) 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液
用于筛选的每张 82 mm 滤膜需要该封闭液 10 ml 或每张 138 mm 滤膜需要 25 ml。
1X 结合缓冲液
每张 82 mm 滤膜需要大约 10 ml 此种封闭液，毎张 138 mm 的滤膜需要 25 ml。
变性溶液（新鲜配制）
用 5 倍体积蒸馏水稀释 10X 结合缓冲液（见上然后在所得 2X 结合缓冲液中加入适当的固体盐酸胍配成 6mol/L 溶液。待盐酸胍完全溶解后，用蒸馏水调整至 1X 结合缓冲液，再加入二硫苏糖醇至终浓度为 1 mmol/L。用于筛选的毎张 82 mm 滤膜需要大约 15 ml 完全变性溶液（6mol/L) 或每张 138 mm 滤膜需要 25 ml。
二硫苏糖醇（1mol/L)
EDTA(0.5 ml/L)
乙醇
10x 激酶/连接酶缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH7.6)
100 mmol/LMgCl2
酚: 氯仿（1:1，v/v)
筛选缓冲液
1x 结合缓冲液
0.25%(m/V) 脱脂奶粉
1 mmol/L 二硫苏糖醇
10ug/ml 变性鲑精 DNA 或鲱精 DNA
每张 82 mm 滤膜需要大约 10 ml 筛选缓冲液或每张 138 ml 滤膜需要 25 ml, 制备变性鲑精或鲱精 DNA 方法请见第 6 章方案 10。
SDS(20%m/V)
醋酸钠（3mol/L，pH5.2)
TE(pH8.0)
酶和缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶
T4 噬菌体多核苷酸激酶
核酸和寡核苷酸
合成的寡核苷酸
20~25 个核苷酸长度的互补序列单链寡核苷酸按照第 10 章方案 1 所述进行凝胶电泳和 Sep-Pak 亲和层析纯化后，溶于 PH7.6 的 TE 溶液使终浓度为 0.2 mg/ml。重新退火时，寡核苷酸的中央区会在经凝胶滞留或 Southwestem 印迹的位置形成与靶蛋白结合的最佳双链单体形式。在第二轮筛选中至少需要一个"突变"寡核苷酸的互补碱基对。当退火时，"突变"寡核苷酸双体的中央区会形成最佳结合位点的缺损形式而不能结含靶蛋白。用一个阳性探针（最佳双链结合序列）和一个阴性探针（密切相关但发生突变的双链序列）进行连续筛选可以消除大多数假阳性。
两对寡核苷酸应设计成具有突出、黏性末端，能够互相连接。
放射活性化合物
[a-32P]ATP(10mCi/ml,5000Ci/mmole)
凝胶
非变性聚丙烯酰胺凝胶
请见步骤 7。
专用设备
用放射活性墨水或化学发光标记的黏性标签重复使用的化学发光标记物可从 Strawgene (Glogos）购得。该标记可多次使用，只是在毎次新一轮自显影前需曝光于荧光灯下。
烤盘（12 英寸 X8 英寸）
结晶皿
平头镊子
装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器
硝酸纤维素滤膜
Sephadex G-75 离心柱，用 TE(pH7.6) 溶液平衡
水浴事先调整至 16°C、65°C 和 85°C
Whatman 3 MM 滤纸
附加试剂
本方案步骤 8 和 10 所需试剂请见本章方案 1。
方法
放射性多联体探针的制备
1. 分别制备两个合成寡核苷酸的磷酸化反应，然后将两者退火：
寡核苷酸 200ng
10X 激酶-连接缓冲液（DDT） 2.5ul
100 mmol/L 二硫苏糖醇 (DDT) 2.5ul
32P ATP 100uCi
水 至 23ul
T4 噬菌体多核苷酸激酶 (8~10 单位/ul) 2.0ul
于 37°C 溫育 1 h。
2. 将两个磷酸化反应混为一体，按以下步骤温育混合物使寡核苷酸退火，若在一热循环仪上进行则最方便
85°C 2 min
65°C 15 min
37°C 15 min
22°C 15 min
4°C 15 min
3. 加入 4ulT4 噬菌体 DAN 连接酶（lWeiss 单位/ul) 和 1ul 50 mml/L ATP, 于 16°C 溫育混合物 12 h。
4. 加入 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 至终浓度为 5mol/L。
5. 用柱层析法通过 Sephadex G-75 柱从未消耗的γ-32P, 单链寡核苷酸和未连接的双链寡核苷酸中分离标记的寡核苷酸（请见附录 8)。
6. 估计终探针的比活度。
标记探针比活度应为大于 2x106cpm/pmole
通过补平退火的未标记多联体寡梭苷酸的 3'末端也可能获得本节所需的比活度连接后，按第 10 章方案 7 所述建立末端补平反应，在每个反应中尽可能用 2 倍的 [a-32P]dNTF 以增加放射性标记产物的比活度。反应结束时，用亲和层析柱从未消耗的 dNTP 中分离标记的寡梭苷酸（请见附录 8)。
7. 利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影（请见附录 9), 分析放射性标记 DNA 的大小。如果上述退火和放射性标记试验一切顺利，应见放射性标记的多联体 DNA 呈阶梯状。
滤膜的制备
8. 制备含有λ噬菌体表达文库的平板，完全按方案 1 步骤 1~8 所述将硝酸纤维素滤膜编号。
如有可能，尽量便用未经扩增的表达文库。因为如果所需蛋白质对细菌有毒性或抑制重组噬菌体的生长，该克隆可能极少表达于扩增文库中。
9. 用平头镊子（如 Millipore 镊于）把编号的硝酸纤维素滤膜从噬菌斑上取出，与噬斑接触的一面向上放到 Whatman3 MM 滤纸上。于室温晾干 15 min。
10. 将第二张浸过 IPTG 的滤膜（已编号）放到菌苔上（见本方案步骤 4）。用一个 18 号针头在每张滤膜上打孔标记，孔的位置与第一张滤膜上的位置相对应。于 37°C 继续温育 2 h, 然后取出滤膜按上述步骤于室溫晾干。
重要：以下步骤均在 4°C 进行。第一组滤膜不经盐酸胍变性直接标记（即略去步骤 11~13), 而第二组滤膜按步骤 11~14 进行。
11. 将滤膜放进一个 12 英寸 X8 英寸的干烤皿里，其中盛有含 4°C 的变性液。于 4°C 在摇床平台上缓慢摇动滤膜 5 min。弃去原变性液换上新鲜变性液。于再摇 5 min。
12. 把第二次加入的变性液倾入量筒中加入等体积含二硫苏糖醇的 1X 结合缓冲液稀释之。再将其倒入一个干净的玻璃盘中，逐张将滤膜放入溶液中，注意务必使每张滤膜能与含二硫苏糖醇的变性液充分接触。
13. 按步骤 12 重复操作 4 次以上，每次均两倍地稀释变性液，使变性液中盐酸胍的浓度依次为 3mol/L(步骤 11),1.5mol/L,0.75mol/L,0.375mol/L,0.187mol/L 和 0.094mol/L。最后用含二硫苏糖醇的 1x 缓冲液洗涤滤膜 2 次。
14. 将两组滤膜（即变性的和非变性的）都放在含 5% 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液中。于 4°C 缓缓摇动 30 min。
15. 用含 0.25% 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液洗涤滤膜。
用放射性探针探测固化蛋白质
16. 在一个结晶皿中，将步骤 5 获得的 32P 标记的多联体探针加到筛选缓冲液中配成的杂交溶液中（每张 82 mm 滤膜用 10 ml 或每张 138 mm 滤膜用 25 ml)。
在筛选反应中当标记探针（持异活性为 2xl08~5x108cpm/ug) 网的终浓度为 25ng/ml 时可以获得最佳结果。然而. 如果探针的量有限，那么最低浓度可用到 2.5ng/ml。该法在最早应用时（Singh et al.1988),poly(dI:dC) 被作为一种非特异竞争物。当使用超声处理的变性鮭精或小牛胸腺 DNA 时，一般可以降低背景。一些 DNA 结合的融合蛋白可能会被任何 DNA, 包括作为竞争模板的 DNA 或其他复合物所遮蔽。因此，在筛选前，应该在凝胶滞后实验或 Southwestern 印迹时（请见第 17 章）先做对各种封闭剂如鮭精 DNA、poly(dl:dC)、poly(A) 及其他试剂的敏感性试验。
17. 将滤膜转移至结晶皿内的放射性标记探针溶液中。于 4°C 旋转平台上缓慢摇动 2~12 h。
本节所选用的结合/筛选缓冲液的离子成分使用于多种 DNA-蛋白质之间的相互作用，然而，在一些试验中，也需要调整盐和镁离子的浓度，使其在凝胶滞后实验或其他方法中结合条件最佳。本节推荐的可供选择的一种结合缓冲液是含有 25 mmol/L HEPES(pH7.9)、25 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DTT(Singh1993) 的缓冲液。
18. 于 4°C 用大量体积（每 82 mm 滤膜用 25 ml, 每 138 mm 滤膜用 60 ml）含 lmmol/L 二硫苏糖醇和 0.25% 脱脂奶粉的结合缓冲液将滤膜漂洗 5 min。
19. 重复步骤 18 两次。
20. 弃去最后一次清洗的缓冲液。将湿滤膜放在一张 Saran 包装膜上，盖上一张 Saran包装膜。再在 Saran 包装膜若干不对称的位置上贴上放射性墨水或化学发光标记的黏性标签纸。
用 Scotch 胶带覆盖放射性标签，以防止放射性墨水污染 X 射线胶片夹或增感屏。
21. 按附录 9 进行放射自显影。
22. 挑选阳性斑，并按本方案导言所述用特异和非特异探针复筛。
可通过重复变性复性过程从滤膜上移去探针，从而滤膜可与其他 DNA 结合蛋白质 cDNA 再杂交。
缓冲液和溶液
贮存液, 缓冲液和试剂的组分请见附录 1。
将贮存液稀释到适当的浓度。
ATP(100 mmol/L)
用 25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 稀释 100 mml/L 贮存液分别配制 10 mmol/L 和 50 mmol/L 两种浓度的 ATP 溶液。
10X 结合缓冲液
250 mmol/LHEPES(pH7.9)
30 mmol/LMgCl2
40 mmol/LKCl
含 1 mmol/L 二硫苏糖醇的 lx 结合缓冲液
该溶液用于稀释完全变性溶液以配制本节中一系列的洗液。请参见步骤 11~13 计算所需的溶液体积。
含 1 mmol/L 二硫苏糖醇和 0.25% 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液
用于筛选的每张 82 mm 滤膜需要 1X 结合缓冲液大约 75 ml,138 mm 的滤要 180 ml。淸洗过程中勿减少使用该缓冲液体积。
含 5%(m/V) 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液
用于筛选的每张 82 mm 滤膜需要该封闭液 10 ml 或每张 138 mm 滤膜需要 25 ml。
含 0.25%(m/V) 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液
用于筛选的每张 82 mm 滤膜需要该封闭液 10 ml 或每张 138 mm 滤膜需要 25 ml。
1X 结合缓冲液
每张 82 mm 滤膜需要大约 10 ml 此种封闭液，毎张 138 mm 的滤膜需要 25 ml。
变性溶液（新鲜配制）
用 5 倍体积蒸馏水稀释 10X 结合缓冲液（见上然后在所得 2X 结合缓冲液中加入适当的固体盐酸胍配成 6mol/L 溶液。待盐酸胍完全溶解后，用蒸馏水调整至 1X 结合缓冲液，再加入二硫苏糖醇至终浓度为 1 mmol/L。用于筛选的毎张 82 mm 滤膜需要大约 15 ml 完全变性溶液（6mol/L) 或每张 138 mm 滤膜需要 25 ml。
二硫苏糖醇（1mol/L)
EDTA(0.5 ml/L)
乙醇
10x 激酶/连接酶缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH7.6)
100 mmol/LMgCl2
酚: 氯仿（1:1，v/v)
筛选缓冲液
1x 结合缓冲液
0.25%(m/V) 脱脂奶粉
1 mmol/L 二硫苏糖醇
10ug/ml 变性鲑精 DNA 或鲱精 DNA
每张 82 mm 滤膜需要大约 10 ml 筛选缓冲液或每张 138 ml 滤膜需要 25 ml, 制备变性鲑精或鲱精 DNA 方法请见第 6 章方案 10。
SDS(20%m/V)
醋酸钠（3mol/L，pH5.2)
TE(pH8.0)
酶和缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶
T4 噬菌体多核苷酸激酶
核酸和寡核苷酸
合成的寡核苷酸
20~25 个核苷酸长度的互补序列单链寡核苷酸按照第 10 章方案 1 所述进行凝胶电泳和 Sep-Pak 亲和层析纯化后，溶于 PH7.6 的 TE 溶液使终浓度为 0.2 mg/ml。重新退火时，寡核苷酸的中央区会在经凝胶滞留或 Southwestem 印迹的位置形成与靶蛋白结合的最佳双链单体形式。在第二轮筛选中至少需要一个"突变"寡核苷酸的互补碱基对。当退火时，"突变"寡核苷酸双体的中央区会形成最佳结合位点的缺损形式而不能结含靶蛋白。用一个阳性探针（最佳双链结合序列）和一个阴性探针（密切相关但发生突变的双链序列）进行连续筛选可以消除大多数假阳性。
两对寡核苷酸应设计成具有突出、黏性末端，能够互相连接。
放射活性化合物
[a-32P]ATP(10mCi/ml,5000Ci/mmole)
凝胶
非变性聚丙烯酰胺凝胶
请见步骤 7。
专用设备
用放射活性墨水或化学发光标记的黏性标签重复使用的化学发光标记物可从 Strawgene (Glogos）购得。该标记可多次使用，只是在毎次新一轮自显影前需曝光于荧光灯下。
烤盘（12 英寸 X8 英寸）
结晶皿
平头镊子
装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器
硝酸纤维素滤膜
Sephadex G-75 离心柱，用 TE(pH7.6) 溶液平衡
水浴事先调整至 16°C、65°C 和 85°C
Whatman 3 MM 滤纸
附加试剂
本方案步骤 8 和 10 所需试剂请见本章方案 1。
方法
放射性多联体探针的制备
1. 分别制备两个合成寡核苷酸的磷酸化反应，然后将两者退火：
寡核苷酸 200ng
10X 激酶-连接缓冲液（DDT） 2.5ul
100 mmol/L 二硫苏糖醇 (DDT) 2.5ul
32P ATP 100uCi
水 至 23ul
T4 噬菌体多核苷酸激酶 (8~10 单位/ul) 2.0ul
于 37°C 溫育 1 h。
2. 将两个磷酸化反应混为一体，按以下步骤温育混合物使寡核苷酸退火，若在一热循环仪上进行则最方便
85°C 2 min
65°C 15 min
37°C 15 min
22°C 15 min
4°C 15 min
3. 加入 4ulT4 噬菌体 DAN 连接酶（lWeiss 单位/ul) 和 1ul 50 mml/L ATP, 于 16°C 溫育混合物 12 h。
4. 加入 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 至终浓度为 5mol/L。
5. 用柱层析法通过 Sephadex G-75 柱从未消耗的γ-32P, 单链寡核苷酸和未连接的双链寡核苷酸中分离标记的寡核苷酸（请见附录 8)。
6. 估计终探针的比活度。
标记探针比活度应为大于 2x106cpm/pmole
通过补平退火的未标记多联体寡梭苷酸的 3'末端也可能获得本节所需的比活度连接后，按第 10 章方案 7 所述建立末端补平反应，在每个反应中尽可能用 2 倍的 [a-32P]dNTF 以增加放射性标记产物的比活度。反应结束时，用亲和层析柱从未消耗的 dNTP 中分离标记的寡梭苷酸（请见附录 8)。
7. 利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影（请见附录 9), 分析放射性标记 DNA 的大小。如果上述退火和放射性标记试验一切顺利，应见放射性标记的多联体 DNA 呈阶梯状。
滤膜的制备
8. 制备含有λ噬菌体表达文库的平板，完全按方案 1 步骤 1~8 所述将硝酸纤维素滤膜编号。
如有可能，尽量便用未经扩增的表达文库。因为如果所需蛋白质对细菌有毒性或抑制重组噬菌体的生长，该克隆可能极少表达于扩增文库中。
9. 用平头镊子（如 Millipore 镊于）把编号的硝酸纤维素滤膜从噬菌斑上取出，与噬斑接触的一面向上放到 Whatman3 MM 滤纸上。于室温晾干 15 min。
10. 将第二张浸过 IPTG 的滤膜（已编号）放到菌苔上（见本方案步骤 4）。用一个 18 号针头在每张滤膜上打孔标记，孔的位置与第一张滤膜上的位置相对应。于 37°C 继续温育 2 h, 然后取出滤膜按上述步骤于室溫晾干。
重要：以下步骤均在 4°C 进行。第一组滤膜不经盐酸胍变性直接标记（即略去步骤 11~13), 而第二组滤膜按步骤 11~14 进行。
11. 将滤膜放进一个 12 英寸 X8 英寸的干烤皿里，其中盛有含 4°C 的变性液。于 4°C 在摇床平台上缓慢摇动滤膜 5 min。弃去原变性液换上新鲜变性液。于再摇 5 min。
12. 把第二次加入的变性液倾入量筒中加入等体积含二硫苏糖醇的 1X 结合缓冲液稀释之。再将其倒入一个干净的玻璃盘中，逐张将滤膜放入溶液中，注意务必使每张滤膜能与含二硫苏糖醇的变性液充分接触。
13. 按步骤 12 重复操作 4 次以上，每次均两倍地稀释变性液，使变性液中盐酸胍的浓度依次为 3mol/L(步骤 11),1.5mol/L,0.75mol/L,0.375mol/L,0.187mol/L 和 0.094mol/L。最后用含二硫苏糖醇的 1x 缓冲液洗涤滤膜 2 次。
14. 将两组滤膜（即变性的和非变性的）都放在含 5% 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液中。于 4°C 缓缓摇动 30 min。
15. 用含 0.25% 脱脂奶粉的 1X 结合缓冲液洗涤滤膜。
用放射性探针探测固化蛋白质
16. 在一个结晶皿中，将步骤 5 获得的 32P 标记的多联体探针加到筛选缓冲液中配成的杂交溶液中（每张 82 mm 滤膜用 10 ml 或每张 138 mm 滤膜用 25 ml)。
在筛选反应中当标记探针（持异活性为 2xl08~5x108cpm/ug) 网的终浓度为 25ng/ml 时可以获得最佳结果。然而. 如果探针的量有限，那么最低浓度可用到 2.5ng/ml。该法在最早应用时（Singh et al.1988),poly(dI:dC) 被作为一种非特异竞争物。当使用超声处理的变性鮭精或小牛胸腺 DNA 时，一般可以降低背景。一些 DNA 结合的融合蛋白可能会被任何 DNA, 包括作为竞争模板的 DNA 或其他复合物所遮蔽。因此，在筛选前，应该在凝胶滞后实验或 Southwestern 印迹时（请见第 17 章）先做对各种封闭剂如鮭精 DNA、poly(dl:dC)、poly(A) 及其他试剂的敏感性试验。
17. 将滤膜转移至结晶皿内的放射性标记探针溶液中。于 4°C 旋转平台上缓慢摇动 2~12 h。
本节所选用的结合/筛选缓冲液的离子成分使用于多种 DNA-蛋白质之间的相互作用，然而，在一些试验中，也需要调整盐和镁离子的浓度，使其在凝胶滞后实验或其他方法中结合条件最佳。本节推荐的可供选择的一种结合缓冲液是含有 25 mmol/L HEPES(pH7.9)、25 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DTT(Singh1993) 的缓冲液。
18. 于 4°C 用大量体积（每 82 mm 滤膜用 25 ml, 每 138 mm 滤膜用 60 ml）含 lmmol/L 二硫苏糖醇和 0.25% 脱脂奶粉的结合缓冲液将滤膜漂洗 5 min。
19. 重复步骤 18 两次。
20. 弃去最后一次清洗的缓冲液。将湿滤膜放在一张 Saran 包装膜上，盖上一张 Saran包装膜。再在 Saran 包装膜若干不对称的位置上贴上放射性墨水或化学发光标记的黏性标签纸。
用 Scotch 胶带覆盖放射性标签，以防止放射性墨水污染 X 射线胶片夹或增感屏。
21. 按附录 9 进行放射自显影。
22. 挑选阳性斑，并按本方案导言所述用特异和非特异探针复筛。
可通过重复变性复性过程从滤膜上移去探针，从而滤膜可与其他 DNA 结合蛋白质 cDNA 再杂交。
来源：丁香实验
