材料与仪器
BAL31 缓冲液 EGTA 乙醇酚 氯仿 醋酸钠 蔗糖凝胶上样缓冲液 TE 噬菌体 T4DNA 聚合酶 BAL31 核酸酶 大肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段 限制性内切酶 琼脂糖凝胶 用于凝胶电泳的 DNA 分子量标准
计时钟 水浴
计时钟 水浴
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1, 将贮存液稀释到合适的浓度。
5XBAL31 缓冲液
2.5mol/LNaCl
62.5 mmol/LCaCl2
62.5 mmol/LMgCl2
100 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
有 4 种 dNTP 的溶液，每种浓度为 0.5 mmol/L
EGTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
醋酸钠（3mol/L，pH5.2)
蔗糖凝胶上样缓冲液
TE(pH7.6)
酶和缓冲液
噬菌体 T4DNA 聚合酶
BAL31 核酸酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段
限制性内切酶
请见步骤 3、23 和 31。
凝胶
琼脂糖凝胶
请见步骤 3 和 32。
含 0.5ug/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶（0.8%)
请见步骤 11。
用 TBE 配制的含 0.5ug/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶
请见歩骤 25。
制备琼脂糖凝胶
请见步骤 27。
核酸和寡核苷酸
用于凝胶电泳的 DNA 分子量标准
专用设备
计时钟
65°C 水浴和适合限制性内切核酸酶消化溫度的水浴
其他试剂
本方案步骤 1 需要的试剂列在第 1 章方案 17~19 或第 3 章方案 6 中。
本方案步骤 2 需要的试剂列在第 1 章方案 9 中。
本方案步骤 27 需要的试剂列在第 5 章方案 4、5、6 或 7 中。
本方案步骤 30 需要的试剂列在第 1 聿方案 23~26 或第 3 章方案 6 或 8 中。
本方案步骤 31 需要的试剂列在第 1 章方案 1 或第 3 章方案 3 中。
本方案步骤 34 需要的试剂列在第 12 章方案 3、4、5 中。
方法
制备用于 BLA31 消化的靶 DNA
1. 将靶 DNA 片段克隆进合适的质粒或噬菌体 M13 载体。
如果拟从靶 DNA 的两个末端同时构建缺失突变体，需要选择有多克隆位点的适当载体将靶 DNA 从两个方向克隆进载体。
2. 用 Qiagen 层析柱（或相当的产品）和乙醇沉淀纯化闭合环状重钽 DNA。把 DNA 重新溶解在最小体积的 Tris/EDTA 溶液中。
使用高纯度的闭合环状 DNA 是很重要的，（i) 降低反应中污染的 RNA 和大肠杆菌染色体 DNA 小片段在总末端浓度中的比例；（ii）删除能够被 BAL31 降解的带缺口的环状 DNA。
3. 用切割位点位于靶 DNA—端的限制酶完全消化 30ug 闭合环状 DNA。界定该位点为嵌套缺失起始的共同点。琼脂糖凝胶电泳验证限制酶消化完全。
4. 等体积的酚: 氯仿抽提纯化 DNA。在微型离心机上以最大离心速度离心 3 min 分离有机相和水相，将水相转移到一个新的微量离心管中。
5. 加入 0.1 倍体积的 3mol/L 醋酸钠（PH5.2) 和 2 倍体积冰上预冷的乙醇。在 O°C 温度下放置 10 min, 在微型离心机上以最大转速 4°C 离心 10 min 收获 DNA。
6. 除去上清，用 70% 的乙醇室温下小心漂洗 DNA 沉淀物。室温下干燥 DNA 沉淀物，用 TE(pH7.6) 缓冲液溶解 DNA 沉淀物使之达到 lug/ul 的余度。在-20°C 条件下贮存 DNA。
BAL31 活性分析
大多数商业化的 BAL31 酶制品含有两种动力学上截然不同的酶活性形式：快形式和慢形式（请见信息栏关于 BAL31)。慢形式是快形式的蛋白水解降解产物。BAL31 消化 DNA 的速率是所用特定酶制剂中快形式与慢形式比例的函数。目前能够得到纯化的快速酶制剂（Weietal.1983), 但很昂贵，而且在贮存过程中经常衰变成慢形式。为了使 BAL31 保持在快形式状态，不应将酶冷冻而要贮存于 4°C。
由于 BAL31 中快、慢形式的比例因制剂而异，因此必须按以下步骤测定用于构建缺失体的特定批次的酶活性。
7. 在微量离心管中混合：
线状 DNA(1ug/ul) 4ul
水 48ul
5XBAL31 缓冲液 13ul
按的量将以上混合物分配到 7 个微量离心管中。
8. 用 1XBAL31 缓冲液把 BAL31 进行 7 次 2 倍稀释，最好按以下方法稀释，将 7 滴（2ul)1XBAL31 缓冲液点在置于冰床或冰冷的金属块上的石蜡膜表面上，用一次性微量移液器吸头吸取 2ul 待实验的 BAL31 酶与第一滴 BAL31 缓冲液混合。换一个新的吸头吸取 2ul 上述 BAL31 和缓冲液的混合物转移至第二滴 BAL31 缓冲液中，再度混合均匀。如此类推，直到所有的 BAL31 缓冲液均已与酶混合。迅速地从后 6 份混合液中分别取出 1 至 6 个含线状 DNA 的微量离心管中，第 7 个反应管中不要加酶。
大多数商业化 BAL31 酶制剂的浓度大约为 1 单位/ul;0.05~0.1 单位的 BAL31 酶足以将 1ug 长度为 2kb 的线状 DNA 分子消化成长度小于 200bp 的片段。
9. 将所有微量离心管（包括不加酶的管）在 30°C 孵育 30 min。
10. 每个反应管中加入 1ul200 mmol/LEGTA(pH8.0), 然后于 65°C 加热 5 min。
BAL31 反应需要 Ca2+, 酶活性可以被 EGTA 完全抑制。65°C 加热 5 min 也可以使该酶灭活。
11. 以上每份样品与 3ul 琼脂糖凝胶上样缓冲液混合，在含 0.5ug/ml 溴化乙锭 (0.8%) 的琼脂糖凝胶上电泳，分析 DNA 的大小。
12. 在紫外灯照射下检査凝胶，并决定合适的酶稀释度，即刚好使 DNA 得到适度的消化，以至只检测到弥散的小片段 DNA(200bp)。该稀释度将被用于大规模消化反应（步骤 15)。
另一种检査 BAL31 消化程度的方法是设 SBAL31 大量消化反应，在不同的时间点上取样。用限制性内切核酸酶消化毎一份样品，限制酶应能切割靶片段数次。随着 BAL31 消化过程的进展，限制酶片段以一定的次序消失。从限制酶片段的大小位置，便能估计出 BAL31 的消化速率。大量消化反应中使用的 BAL31 量应在反应开始后的前 5 min 内足以使靶片段的长度减少 20%。
用 BAL31 进行大量消化
13. 混合
线状 DNA(1ug/ul) 20ul
水 240ul
5XBAL31 缓冲液 65ul
30°C 水浴中孵育以上混合物。
14.30°C 孵育期间，准备 8 个微量离心管，每管中含有 5ul 200 mmol/LEGTA(pH8.0)，将离心管标记为 1.5 min、3 min、4.5 min 等时间段。
15. 将 36ul 稀释的 BAL31(请见步骤 12) 加入到步骤 13 反应混合物中，轻敲离心管壁，将内容物快速混合均匀后放回到 30°C 水浴中，开始计时。
16. 每隔 1.5 min 将 45ul 反应混合物转移到带相应标记的微量离心管中，将离心管置于冰上，直到所有样品收集完毕。
17.65°C 加热 5 min 灭活 BAL31 酶。
18. 每管中加入 5ul 3 ml/L 的醋酸钠（PH5.2), 再加入 100ul 冰冷的乙醇，振荡混合溶液，将离心管放置在冰上 20~30 min。
19. 最大转速 4°C 离心回收 DNA, 除去上清，用 200ul 冰冷的 70% 的乙醇洗涤沉淀物，再离心 2 min。
20. 仔细的去除上清，将敞开管盖的离心管直立放置在室温，直到所有的乙醇挥发殆尽。将每份沉淀物溶解在 23ulTE(pH7.6) 中。
分离截短的靶片段
21. 每份 DNA 制备物中加人：
0.5 mmol/LdNTP 溶液 3ul
10X 聚合酶缓冲液 3ul
噬菌体 T4DNA 聚合酶（约 5 单位） 1ul
室温下反应 15 min, 然后加入 1(约 5 单位）的 Klenow 片段。继续在室温下孵育 15 min。
在修复反应中使用两种不同的 DNA 聚合酶，可使突变体的回收率增加近三倍。
22. 用酚: 氯仿抽提纯化 DNA, 按步骤 18~20 所描述的过程用乙醇沉淀 DNA。将每份 DNA 溶解在 16ulTE(pH7.6) 中。
23. 在毎一份 DNA 中加入 2ul 相应的 10x 限制酶缓冲液和 8 单位的可使靶 DNA 和载体分开的限制酶，在适当的温度下孵育反应 1h。
24. 在孵育结束时，从每一个消化反应中取出 3ul 转移至一个新的微量离心管中，剩余的消化反应放置在冰上以备步骤 27 使用。
25. 每 3ul 上述反应液中加入 1ul 蔗糖凝胶上样缓冲液混合，将样品加到含有 0.5ug/ml 溴化乙锭和 0.5XTBE 的琼脂糖凝胶加样孔中。凝胶边上的加样孔内应加入一个适当大小的分子量标准参照物。
灌制的琼脂糖凝胶的浓度应适合分离靶片段和栽体（请见第 5 章导言部分的表 5-2)。
26. 利用凝胶电泳分离靶片段和载体 DNA, 在紫外光照射下观察凝胶，并决定哪份样品已被 BAL31 消化至合适的大小。
27. 合并含合适大小靶 DNA 的质粒样品，按第 5 章方案 4~7 描述的方法通过制备凝胶分离并回收靶 DNA 片段。
28. 根据溴化乙锭产生的荧光强度，估计出所纯化的靶 DNA 量。
克隆缺失的靶片段
29. 用质粒、噬菌粒或噬菌体 M13 载体（见第 1 或第 3 章）与缺失的粑片段连接。载体应携带一个钝端和一个与步骤 23 使用的内切酶相匹配的末端。
连接反应的确切成分和体积取决于靶 DNA 的量，如果可能，应使用 50ng 或 100ng 靶 DNA。保证载体 DNA 对靶 DNA 的摩尔比至少为 5(以便最大限度地减少含有一个以上靶 DNA 片段重组子的数量)。为了最大限度地形成重组体，连接反应应在适于钝端连接的条件下进行，例如在高浓度的噬菌体 T4DNA 连接酶、聚乙二醇和低浓度 ATP 的小反应体积中进行。有关连接条件的详细情况，请见第 1 章方案 19。
30. 用小量的或稀释的连接混合物转化（质粒或噬菌粒）或转染（噬菌体 M13 复制型 DNA) 合适的大肠杆菌感受态菌株。第二天随机挑选 12 个转化菌落或噬菌体 M13
噬斑进行少量培养。
31. 采用第 1 章或第 3 章描述的方法之一从 12 个培养物中纯化质粒、噬菌粒或噬菌体 M13 复制形式 DNA。用可从载体中切出靶片段的限制酶消化 DNA。
32. 通过凝胶电泳和大小合适的 DNA 分子量标准参照物分析从每种 DNA 中切出的靶片段的大小。
33. 如果结果是满意的（例如靶片段的大小在希望的范围内），可大量挑取相互独立的转化单菌落或噬斑。按上述方法鉴定插入片段的大小。保留携带大小符合的重组子培养物。
34. 通过 DNA 测序确定每种突变体缺失位点的准确部位（请见第 12 章方案 3、4 或 5)。
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1, 将贮存液稀释到合适的浓度。
5XBAL31 缓冲液
2.5mol/LNaCl
62.5 mmol/LCaCl2
62.5 mmol/LMgCl2
100 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
有 4 种 dNTP 的溶液，每种浓度为 0.5 mmol/L
EGTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
醋酸钠（3mol/L，pH5.2)
蔗糖凝胶上样缓冲液
TE(pH7.6)
酶和缓冲液
噬菌体 T4DNA 聚合酶
BAL31 核酸酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段
限制性内切酶
请见步骤 3、23 和 31。
凝胶
琼脂糖凝胶
请见步骤 3 和 32。
含 0.5ug/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶（0.8%)
请见步骤 11。
用 TBE 配制的含 0.5ug/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶
请见歩骤 25。
制备琼脂糖凝胶
请见步骤 27。
核酸和寡核苷酸
用于凝胶电泳的 DNA 分子量标准
专用设备
计时钟
65°C 水浴和适合限制性内切核酸酶消化溫度的水浴
其他试剂
本方案步骤 1 需要的试剂列在第 1 章方案 17~19 或第 3 章方案 6 中。
本方案步骤 2 需要的试剂列在第 1 章方案 9 中。
本方案步骤 27 需要的试剂列在第 5 章方案 4、5、6 或 7 中。
本方案步骤 30 需要的试剂列在第 1 聿方案 23~26 或第 3 章方案 6 或 8 中。
本方案步骤 31 需要的试剂列在第 1 章方案 1 或第 3 章方案 3 中。
本方案步骤 34 需要的试剂列在第 12 章方案 3、4、5 中。
方法
制备用于 BLA31 消化的靶 DNA
1. 将靶 DNA 片段克隆进合适的质粒或噬菌体 M13 载体。
如果拟从靶 DNA 的两个末端同时构建缺失突变体，需要选择有多克隆位点的适当载体将靶 DNA 从两个方向克隆进载体。
2. 用 Qiagen 层析柱（或相当的产品）和乙醇沉淀纯化闭合环状重钽 DNA。把 DNA 重新溶解在最小体积的 Tris/EDTA 溶液中。
使用高纯度的闭合环状 DNA 是很重要的，（i) 降低反应中污染的 RNA 和大肠杆菌染色体 DNA 小片段在总末端浓度中的比例；（ii）删除能够被 BAL31 降解的带缺口的环状 DNA。
3. 用切割位点位于靶 DNA—端的限制酶完全消化 30ug 闭合环状 DNA。界定该位点为嵌套缺失起始的共同点。琼脂糖凝胶电泳验证限制酶消化完全。
4. 等体积的酚: 氯仿抽提纯化 DNA。在微型离心机上以最大离心速度离心 3 min 分离有机相和水相，将水相转移到一个新的微量离心管中。
5. 加入 0.1 倍体积的 3mol/L 醋酸钠（PH5.2) 和 2 倍体积冰上预冷的乙醇。在 O°C 温度下放置 10 min, 在微型离心机上以最大转速 4°C 离心 10 min 收获 DNA。
6. 除去上清，用 70% 的乙醇室温下小心漂洗 DNA 沉淀物。室温下干燥 DNA 沉淀物，用 TE(pH7.6) 缓冲液溶解 DNA 沉淀物使之达到 lug/ul 的余度。在-20°C 条件下贮存 DNA。
BAL31 活性分析
大多数商业化的 BAL31 酶制品含有两种动力学上截然不同的酶活性形式：快形式和慢形式（请见信息栏关于 BAL31)。慢形式是快形式的蛋白水解降解产物。BAL31 消化 DNA 的速率是所用特定酶制剂中快形式与慢形式比例的函数。目前能够得到纯化的快速酶制剂（Weietal.1983), 但很昂贵，而且在贮存过程中经常衰变成慢形式。为了使 BAL31 保持在快形式状态，不应将酶冷冻而要贮存于 4°C。
由于 BAL31 中快、慢形式的比例因制剂而异，因此必须按以下步骤测定用于构建缺失体的特定批次的酶活性。
7. 在微量离心管中混合：
线状 DNA(1ug/ul) 4ul
水 48ul
5XBAL31 缓冲液 13ul
按的量将以上混合物分配到 7 个微量离心管中。
8. 用 1XBAL31 缓冲液把 BAL31 进行 7 次 2 倍稀释，最好按以下方法稀释，将 7 滴（2ul)1XBAL31 缓冲液点在置于冰床或冰冷的金属块上的石蜡膜表面上，用一次性微量移液器吸头吸取 2ul 待实验的 BAL31 酶与第一滴 BAL31 缓冲液混合。换一个新的吸头吸取 2ul 上述 BAL31 和缓冲液的混合物转移至第二滴 BAL31 缓冲液中，再度混合均匀。如此类推，直到所有的 BAL31 缓冲液均已与酶混合。迅速地从后 6 份混合液中分别取出 1 至 6 个含线状 DNA 的微量离心管中，第 7 个反应管中不要加酶。
大多数商业化 BAL31 酶制剂的浓度大约为 1 单位/ul;0.05~0.1 单位的 BAL31 酶足以将 1ug 长度为 2kb 的线状 DNA 分子消化成长度小于 200bp 的片段。
9. 将所有微量离心管（包括不加酶的管）在 30°C 孵育 30 min。
10. 每个反应管中加入 1ul200 mmol/LEGTA(pH8.0), 然后于 65°C 加热 5 min。
BAL31 反应需要 Ca2+, 酶活性可以被 EGTA 完全抑制。65°C 加热 5 min 也可以使该酶灭活。
11. 以上每份样品与 3ul 琼脂糖凝胶上样缓冲液混合，在含 0.5ug/ml 溴化乙锭 (0.8%) 的琼脂糖凝胶上电泳，分析 DNA 的大小。
12. 在紫外灯照射下检査凝胶，并决定合适的酶稀释度，即刚好使 DNA 得到适度的消化，以至只检测到弥散的小片段 DNA(200bp)。该稀释度将被用于大规模消化反应（步骤 15)。
另一种检査 BAL31 消化程度的方法是设 SBAL31 大量消化反应，在不同的时间点上取样。用限制性内切核酸酶消化毎一份样品，限制酶应能切割靶片段数次。随着 BAL31 消化过程的进展，限制酶片段以一定的次序消失。从限制酶片段的大小位置，便能估计出 BAL31 的消化速率。大量消化反应中使用的 BAL31 量应在反应开始后的前 5 min 内足以使靶片段的长度减少 20%。
用 BAL31 进行大量消化
13. 混合
线状 DNA(1ug/ul) 20ul
水 240ul
5XBAL31 缓冲液 65ul
30°C 水浴中孵育以上混合物。
14.30°C 孵育期间，准备 8 个微量离心管，每管中含有 5ul 200 mmol/LEGTA(pH8.0)，将离心管标记为 1.5 min、3 min、4.5 min 等时间段。
15. 将 36ul 稀释的 BAL31(请见步骤 12) 加入到步骤 13 反应混合物中，轻敲离心管壁，将内容物快速混合均匀后放回到 30°C 水浴中，开始计时。
16. 每隔 1.5 min 将 45ul 反应混合物转移到带相应标记的微量离心管中，将离心管置于冰上，直到所有样品收集完毕。
17.65°C 加热 5 min 灭活 BAL31 酶。
18. 每管中加入 5ul 3 ml/L 的醋酸钠（PH5.2), 再加入 100ul 冰冷的乙醇，振荡混合溶液，将离心管放置在冰上 20~30 min。
19. 最大转速 4°C 离心回收 DNA, 除去上清，用 200ul 冰冷的 70% 的乙醇洗涤沉淀物，再离心 2 min。
20. 仔细的去除上清，将敞开管盖的离心管直立放置在室温，直到所有的乙醇挥发殆尽。将每份沉淀物溶解在 23ulTE(pH7.6) 中。
分离截短的靶片段
21. 每份 DNA 制备物中加人：
0.5 mmol/LdNTP 溶液 3ul
10X 聚合酶缓冲液 3ul
噬菌体 T4DNA 聚合酶（约 5 单位） 1ul
室温下反应 15 min, 然后加入 1(约 5 单位）的 Klenow 片段。继续在室温下孵育 15 min。
在修复反应中使用两种不同的 DNA 聚合酶，可使突变体的回收率增加近三倍。
22. 用酚: 氯仿抽提纯化 DNA, 按步骤 18~20 所描述的过程用乙醇沉淀 DNA。将每份 DNA 溶解在 16ulTE(pH7.6) 中。
23. 在毎一份 DNA 中加入 2ul 相应的 10x 限制酶缓冲液和 8 单位的可使靶 DNA 和载体分开的限制酶，在适当的温度下孵育反应 1h。
24. 在孵育结束时，从每一个消化反应中取出 3ul 转移至一个新的微量离心管中，剩余的消化反应放置在冰上以备步骤 27 使用。
25. 每 3ul 上述反应液中加入 1ul 蔗糖凝胶上样缓冲液混合，将样品加到含有 0.5ug/ml 溴化乙锭和 0.5XTBE 的琼脂糖凝胶加样孔中。凝胶边上的加样孔内应加入一个适当大小的分子量标准参照物。
灌制的琼脂糖凝胶的浓度应适合分离靶片段和栽体（请见第 5 章导言部分的表 5-2)。
26. 利用凝胶电泳分离靶片段和载体 DNA, 在紫外光照射下观察凝胶，并决定哪份样品已被 BAL31 消化至合适的大小。
27. 合并含合适大小靶 DNA 的质粒样品，按第 5 章方案 4~7 描述的方法通过制备凝胶分离并回收靶 DNA 片段。
28. 根据溴化乙锭产生的荧光强度，估计出所纯化的靶 DNA 量。
克隆缺失的靶片段
29. 用质粒、噬菌粒或噬菌体 M13 载体（见第 1 或第 3 章）与缺失的粑片段连接。载体应携带一个钝端和一个与步骤 23 使用的内切酶相匹配的末端。
连接反应的确切成分和体积取决于靶 DNA 的量，如果可能，应使用 50ng 或 100ng 靶 DNA。保证载体 DNA 对靶 DNA 的摩尔比至少为 5(以便最大限度地减少含有一个以上靶 DNA 片段重组子的数量)。为了最大限度地形成重组体，连接反应应在适于钝端连接的条件下进行，例如在高浓度的噬菌体 T4DNA 连接酶、聚乙二醇和低浓度 ATP 的小反应体积中进行。有关连接条件的详细情况，请见第 1 章方案 19。
30. 用小量的或稀释的连接混合物转化（质粒或噬菌粒）或转染（噬菌体 M13 复制型 DNA) 合适的大肠杆菌感受态菌株。第二天随机挑选 12 个转化菌落或噬菌体 M13
噬斑进行少量培养。
31. 采用第 1 章或第 3 章描述的方法之一从 12 个培养物中纯化质粒、噬菌粒或噬菌体 M13 复制形式 DNA。用可从载体中切出靶片段的限制酶消化 DNA。
32. 通过凝胶电泳和大小合适的 DNA 分子量标准参照物分析从每种 DNA 中切出的靶片段的大小。
33. 如果结果是满意的（例如靶片段的大小在希望的范围内），可大量挑取相互独立的转化单菌落或噬斑。按上述方法鉴定插入片段的大小。保留携带大小符合的重组子培养物。
34. 通过 DNA 测序确定每种突变体缺失位点的准确部位（请见第 12 章方案 3、4 或 5)。
来源：丁香实验
