材料与仪器
纯化的鼠肝质膜 牛血清白蛋白 [125I] 胰岛素 猪胰岛素 牛γ-球蛋白 聚乙二醇 6000 溶液 B 溶液 C 结合缓冲液
Ti 70 转头和带盖的聚丙烯离心管
Ti 70 转头和带盖的聚丙烯离心管
步骤
材料与设备
纯化的鼠肝质膜（得自实验 1)
Ti 70 转头和带盖的聚丙烯离心管
牛血清白蛋白（BSA,1%)
[125I] 胰岛素（受体级，DuPont NEN NEX 196)
猪胰岛素〔17.5umol/L(0.1 mg/ml), 于 0.001mol/LHCl 中〕（Sigma Chemical Co.I3505)
牛γ-球蛋白（0.4%，于溶液 B)(Miles Laboratories Co.82-041-2)
聚乙二醇 6000(20% 水溶液）
试剂
溶液 B
溶液 C
结合缓冲液（溶解受体用）
(配方，见"试剂的配制" PP.234~240)
操作程序
用 TritonX-100 溶解胰岛素受体
比较 TritonX-100 与其他去垢剂从鼠肝质膜上溶解胰岛素受体的效率，其结果见表 4-3。
1）取 100~150 mg 纯的鼠肝质膜，与 10 ml 溶液 B 混合，再加 4 ml 溶液 4℃孵育 30 min。
2) 悬液 200000 g（Ti 70 转头，45000r/min) 离心 30 min, 用巴氏吸管收集上清，注意不要搅动沉淀。
注: 常存在 TritonX-100 不溶的沉淀物，紧粘于管底。
胰岛素对溶解受体结合活性的测定
1) 于微量离心管中建立如下反应体系：
从 A 管得出总的结合量，从 B 管得出非特异结合量。
特异结合量=总结合量-非特异结合量。
注：受体纯的 [125I] 胰岛索（NEX 196) 购自 DuPont NEN 公司，比放射性强度为 2200uCi/nmol。胰岛素浓度为 35.5nmol/L。在本试验中，必须用结合缓冲液将 [125I] 胰岛素储液稀释至 5nmol/L。在溶解受体的受体结合试验中需 [125I] 胰岛素的终浓度为 500pmol/L，相当于 300-ul 反应体系中加入 30ul 5nmol/L 的溶液。
2) 反应体系在 44℃ 孵育16 h, 或室温孵育 2 h。
3) 沉淀，将受体结合的胰岛素与游离胰岛素分开。加入 75ul 含 0.4% 牛γ-球蛋白的溶液 B,44℃ 孵育 5 min。再加 375ul 20% 聚乙二醇 6000, 44℃ 孵育 10 min。混合物于微型离心机中离心 10 min, 收集沉淀。尽量除尽各管上清，计数沉淀的放射性强度。
注：在纯化过程中，虽常用聚乙二醇沉淀法测定胰岛索受体数，但此法多半会低估结合位点的绝对数，因为沉淀的只是胰岛素-受体复合物的一部分（Finn 等，1984)。为测定胰岛素对其受体的亲和性，要加入几种不同浓度的未标记胰岛素. 使胰岛索终浓度为 500pmol/L 至 200nmol/L，如本单元实验 1 所述。
纯化的鼠肝质膜（得自实验 1)
Ti 70 转头和带盖的聚丙烯离心管
牛血清白蛋白（BSA,1%)
[125I] 胰岛素（受体级，DuPont NEN NEX 196)
猪胰岛素〔17.5umol/L(0.1 mg/ml), 于 0.001mol/LHCl 中〕（Sigma Chemical Co.I3505)
牛γ-球蛋白（0.4%，于溶液 B)(Miles Laboratories Co.82-041-2)
聚乙二醇 6000(20% 水溶液）
试剂
溶液 B
溶液 C
结合缓冲液（溶解受体用）
(配方，见"试剂的配制" PP.234~240)
操作程序
用 TritonX-100 溶解胰岛素受体
比较 TritonX-100 与其他去垢剂从鼠肝质膜上溶解胰岛素受体的效率，其结果见表 4-3。
1）取 100~150 mg 纯的鼠肝质膜，与 10 ml 溶液 B 混合，再加 4 ml 溶液 4℃孵育 30 min。
2) 悬液 200000 g（Ti 70 转头，45000r/min) 离心 30 min, 用巴氏吸管收集上清，注意不要搅动沉淀。
注: 常存在 TritonX-100 不溶的沉淀物，紧粘于管底。
胰岛素对溶解受体结合活性的测定
1) 于微量离心管中建立如下反应体系：
从 A 管得出总的结合量，从 B 管得出非特异结合量。
特异结合量=总结合量-非特异结合量。
注：受体纯的 [125I] 胰岛索（NEX 196) 购自 DuPont NEN 公司，比放射性强度为 2200uCi/nmol。胰岛素浓度为 35.5nmol/L。在本试验中，必须用结合缓冲液将 [125I] 胰岛素储液稀释至 5nmol/L。在溶解受体的受体结合试验中需 [125I] 胰岛素的终浓度为 500pmol/L，相当于 300-ul 反应体系中加入 30ul 5nmol/L 的溶液。
2) 反应体系在 44℃ 孵育16 h, 或室温孵育 2 h。
3) 沉淀，将受体结合的胰岛素与游离胰岛素分开。加入 75ul 含 0.4% 牛γ-球蛋白的溶液 B,44℃ 孵育 5 min。再加 375ul 20% 聚乙二醇 6000, 44℃ 孵育 10 min。混合物于微型离心机中离心 10 min, 收集沉淀。尽量除尽各管上清，计数沉淀的放射性强度。
注：在纯化过程中，虽常用聚乙二醇沉淀法测定胰岛索受体数，但此法多半会低估结合位点的绝对数，因为沉淀的只是胰岛素-受体复合物的一部分（Finn 等，1984)。为测定胰岛素对其受体的亲和性，要加入几种不同浓度的未标记胰岛素. 使胰岛索终浓度为 500pmol/L 至 200nmol/L，如本单元实验 1 所述。
来源：丁香实验
