材料与仪器
XK26 40 柱 SephacrylS-300 HR 蓝葡聚糖 TM 缓冲液+0.1mol LKCl
步骤
材料和设备
XK26/40 柱（PharmaciaBiotech,Inundefined)
SephacrylS-300 HR(PharmaciaBiotech,Inc.)
蓝葡聚糖
试剂
TM 缓冲液+0.1mol/LKCl
(配方，见“试剂的配制”，PP.131-138.)
操作裎序
1) 确定填料的用量。市售的 Sephacryl S-300 HR 胶是浓度为 2/3 填充床体积的浆状物。因此，对于 180 ml 的柱子（直径=2.6 cm，长=34 cm)，可从瓶中取出 270 mlS-300 的浆状物。
注：装填凝胶过滤柱时，填料床的均匀性非常重要。还应注意，进行髙分辨率分离时, 较细、较长的柱子要有效得多。
2) 在粗烧结玻板漏斗中，用数倍体积的 TM 缓冲液+0.1mol/L KCl 充分洗涤 S-300 胶。
注：操作时要温和 (尤其在搅拌时), 以防易碎的胶粒破碎。
3) 温和地将填料悬浮于 TM 缓冲液+0.1mol/L KCl 中，至终体积为所需填充床体积的 2 倍（360 ml)。
4)(此步可任选，但建议做）置浆状的 S-300 胶于真空下脱气数分钟。此过程可去除介质和缓冲液中溶解的气体。
5) 立起柱子，其上带有储液槽盛放 S-300 胶和缓冲液。要确保柱子绝对垂直。关闭柱底部的出口。
6) 于空柱中加入约为 1/10 柱体积的缓冲液（约 20 ml)。
7) 连续不断地将浆状的 S-300 胶注入柱子。
注：严防气泡进入凝胶过滤柱，这一点很重要，即使是小气泡也会毁坏柱子，如是就必须重新装柱。
8) 静置约 30 min, 然后打开柱底部的出口，让缓冲液从柱中流过。
9)S-300 胶沉降完毕后，关闭柱底部出口，移走柱上的储液槽，于填充床顶部接上柱液流接头。注意，在上液流接头接上柱之前，务必使其充满缓冲液，否则就会由此液流接头带入气泡。
10) 将上液流接头与泵连接（当心气泡），开始用泵装压柱子。先以层析样品时所用的流速装压柱子（对本实验中的柱子，流速为 100 ml/h)。装压时，要注意观察填料的顶部，随着填料顶部的下沉，下调上液流接头，使之始终处于填料床的顶部。然后，当填料停止下沉后，将流速增至层析流速的 150%(对于 S-300 柱来说，即把流速增至 150 ml/h)。继续压柱（并调节上液流接头，直至填料不再进一步压缩。此时层析柱即装填完毕，备用。
注：装柱时，缓冲液中不必添加蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇。但样品上柱前，必须用至少为一个完整体积的含这些成分的缓冲液平衡柱子。
11）为检验柱子的性能，一个好的办法是上一份 2 mg/ml 的蓝葡聚糖样品于新装填的柱子进行层析。不要再原先上过蛋白质样品的柱子上层析蓝葡聚糖。用层析缓冲液（TM 缓冲液+0.1mol/L KCl) 制备 2 mg/ml 的蓝葡聚糖溶液，过滤（用 0.22um 滤膜除去小的、不溶的蓝葡聚糖顆粒。蓝葡聚糖按约 2% 总柱体积的量（对于 S-300 柱，约 4 ml) 上样，以 2.5 ml 为一管分部收集各组分。用蓝葡聚糖进行的层析可提供以下信息：①空体积；②样品稀释程度;③柱的总体质量，这可通过肉眼观察蓝葡聚糖在柱中的下移情况来判定，由此可揭示柱床的不足之处。
XK26/40 柱（PharmaciaBiotech,Inundefined)
SephacrylS-300 HR(PharmaciaBiotech,Inc.)
蓝葡聚糖
试剂
TM 缓冲液+0.1mol/LKCl
(配方，见“试剂的配制”，PP.131-138.)
操作裎序
1) 确定填料的用量。市售的 Sephacryl S-300 HR 胶是浓度为 2/3 填充床体积的浆状物。因此，对于 180 ml 的柱子（直径=2.6 cm，长=34 cm)，可从瓶中取出 270 mlS-300 的浆状物。
注：装填凝胶过滤柱时，填料床的均匀性非常重要。还应注意，进行髙分辨率分离时, 较细、较长的柱子要有效得多。
2) 在粗烧结玻板漏斗中，用数倍体积的 TM 缓冲液+0.1mol/L KCl 充分洗涤 S-300 胶。
注：操作时要温和 (尤其在搅拌时), 以防易碎的胶粒破碎。
3) 温和地将填料悬浮于 TM 缓冲液+0.1mol/L KCl 中，至终体积为所需填充床体积的 2 倍（360 ml)。
4)(此步可任选，但建议做）置浆状的 S-300 胶于真空下脱气数分钟。此过程可去除介质和缓冲液中溶解的气体。
5) 立起柱子，其上带有储液槽盛放 S-300 胶和缓冲液。要确保柱子绝对垂直。关闭柱底部的出口。
6) 于空柱中加入约为 1/10 柱体积的缓冲液（约 20 ml)。
7) 连续不断地将浆状的 S-300 胶注入柱子。
注：严防气泡进入凝胶过滤柱，这一点很重要，即使是小气泡也会毁坏柱子，如是就必须重新装柱。
8) 静置约 30 min, 然后打开柱底部的出口，让缓冲液从柱中流过。
9)S-300 胶沉降完毕后，关闭柱底部出口，移走柱上的储液槽，于填充床顶部接上柱液流接头。注意，在上液流接头接上柱之前，务必使其充满缓冲液，否则就会由此液流接头带入气泡。
10) 将上液流接头与泵连接（当心气泡），开始用泵装压柱子。先以层析样品时所用的流速装压柱子（对本实验中的柱子，流速为 100 ml/h)。装压时，要注意观察填料的顶部，随着填料顶部的下沉，下调上液流接头，使之始终处于填料床的顶部。然后，当填料停止下沉后，将流速增至层析流速的 150%(对于 S-300 柱来说，即把流速增至 150 ml/h)。继续压柱（并调节上液流接头，直至填料不再进一步压缩。此时层析柱即装填完毕，备用。
注：装柱时，缓冲液中不必添加蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇。但样品上柱前，必须用至少为一个完整体积的含这些成分的缓冲液平衡柱子。
11）为检验柱子的性能，一个好的办法是上一份 2 mg/ml 的蓝葡聚糖样品于新装填的柱子进行层析。不要再原先上过蛋白质样品的柱子上层析蓝葡聚糖。用层析缓冲液（TM 缓冲液+0.1mol/L KCl) 制备 2 mg/ml 的蓝葡聚糖溶液，过滤（用 0.22um 滤膜除去小的、不溶的蓝葡聚糖顆粒。蓝葡聚糖按约 2% 总柱体积的量（对于 S-300 柱，约 4 ml) 上样，以 2.5 ml 为一管分部收集各组分。用蓝葡聚糖进行的层析可提供以下信息：①空体积；②样品稀释程度;③柱的总体质量，这可通过肉眼观察蓝葡聚糖在柱中的下移情况来判定，由此可揭示柱床的不足之处。
来源：丁香实验
