材料与仪器
MLCK 的底物肽 ATP 钙调蛋白储液 MLCK 酶 磷酸 丙酮(任选) MLCK 测活缓冲液
聚丙烯微量离心管 WhatmaundefinedP81 磷酸纤维素纸(切成条) 玻璃烧杯 加样器 闪烁瓶 闪烁计数器 吹干机(任选)
聚丙烯微量离心管 WhatmaundefinedP81 磷酸纤维素纸(切成条) 玻璃烧杯 加样器 闪烁瓶 闪烁计数器 吹干机(任选)
步骤
材料与设备
聚丙烯微量离心管 (1.5-ml)
MLCK 的底物肽(10mmol/L 浓缩储液;测活时,用水按 1:20 稀释成 0.5 mmol/L溶液)
ATP(2 mmol/L 储液,含 5μCi 的 [γ-32P]ATP/5ul)
钙调蛋白储液 (0.1ug/ml 或 1ug/ml)
MLCK 酶(浓缩储液保存于-70°C; 测活时,用 1mg/ml 牛血清白蛋白按 1:200稀释)
水浴
WhatmaundefinedP81 磷酸纤维素纸(切成条)
磷酸(75 mmol/L)(3X4L)
玻璃烧杯(3~4L 容积)
加样器(3~10-ml)
闪烁瓶
闪烁计数器
丙酮(任选)
吹干机(任选)
试剂
MLCK 测活缓冲液(10x)
(配方,见“试剂的配制”,PP.82~83)
操作程序
1) 对每次测活,将下列试剂置于一 1.5-ml 聚丙烯微量离心管中:
MLCK 测活缓冲液 (10x) 5ul
MLCK 的底物肽 (0.5 mmol/L) 5ul
[γ-32P]ATP(2 mmol/L 35uCi/5ul) 5ul
钙调蛋白(0.1ug/ml 或 1ug/ml) 或各步纯化所得的未知样品 0~20ul
Milli-Q 水 10~30ul
MLCK 酶 (储液按 1:200 稀释) 5ul
总体积 50ul
注:各步纯化所得的组分, 若含 EDTA 或 EGTA, 则应制成过量的 1mmol/LCaCl2 溶液。每个组分应测几个稀释度,如 1:10、1:100 和 1:1000。在上述条件下,钙调蛋白的半数有效剂置约为 4ng。MLCK 试验的钙调蛋白 (0.2~20ng) 标准曲线,见图 1-2。
![](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2015/09/A1441099256png_small.jpg)
2) 开始实验,加人 MLCK 酶。25°C,孵育 20 min(分钟)。
3) 将离心管置于冰上。从每管中取出 10-ul 等分试样,滴于一小面积的 P81 纸上。可用一条 P81 纸条, 在其上每隔 2~3 cm 用铅笔写上序号(与离心管的序号对应)。
4) 纸条用 75mmol/L 磷酸洗 3 次,用移液管手动搅拌 ,每次洗涤在玻璃烧杯中进行,用移液管转移纸条。第一次洗过的溶液应置于放射性废液中。洗毕,吹干,将纸条剪成小片,置闪烁瓶中计数。或者,纸条也可用丙酮洗涤,并用手持吹干机快速吹干(MarshA 和 Carroll,1991)。
聚丙烯微量离心管 (1.5-ml)
MLCK 的底物肽(10mmol/L 浓缩储液;测活时,用水按 1:20 稀释成 0.5 mmol/L溶液)
ATP(2 mmol/L 储液,含 5μCi 的 [γ-32P]ATP/5ul)
钙调蛋白储液 (0.1ug/ml 或 1ug/ml)
MLCK 酶(浓缩储液保存于-70°C; 测活时,用 1mg/ml 牛血清白蛋白按 1:200稀释)
水浴
WhatmaundefinedP81 磷酸纤维素纸(切成条)
磷酸(75 mmol/L)(3X4L)
玻璃烧杯(3~4L 容积)
加样器(3~10-ml)
闪烁瓶
闪烁计数器
丙酮(任选)
吹干机(任选)
试剂
MLCK 测活缓冲液(10x)
(配方,见“试剂的配制”,PP.82~83)
操作程序
1) 对每次测活,将下列试剂置于一 1.5-ml 聚丙烯微量离心管中:
MLCK 测活缓冲液 (10x) 5ul
MLCK 的底物肽 (0.5 mmol/L) 5ul
[γ-32P]ATP(2 mmol/L 35uCi/5ul) 5ul
钙调蛋白(0.1ug/ml 或 1ug/ml) 或各步纯化所得的未知样品 0~20ul
Milli-Q 水 10~30ul
MLCK 酶 (储液按 1:200 稀释) 5ul
总体积 50ul
注:各步纯化所得的组分, 若含 EDTA 或 EGTA, 则应制成过量的 1mmol/LCaCl2 溶液。每个组分应测几个稀释度,如 1:10、1:100 和 1:1000。在上述条件下,钙调蛋白的半数有效剂置约为 4ng。MLCK 试验的钙调蛋白 (0.2~20ng) 标准曲线,见图 1-2。
![](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2015/09/A1441099256png_small.jpg)
2) 开始实验,加人 MLCK 酶。25°C,孵育 20 min(分钟)。
3) 将离心管置于冰上。从每管中取出 10-ul 等分试样,滴于一小面积的 P81 纸上。可用一条 P81 纸条, 在其上每隔 2~3 cm 用铅笔写上序号(与离心管的序号对应)。
4) 纸条用 75mmol/L 磷酸洗 3 次,用移液管手动搅拌 ,每次洗涤在玻璃烧杯中进行,用移液管转移纸条。第一次洗过的溶液应置于放射性废液中。洗毕,吹干,将纸条剪成小片,置闪烁瓶中计数。或者,纸条也可用丙酮洗涤,并用手持吹干机快速吹干(MarshA 和 Carroll,1991)。
来源:丁香实验