材料与仪器
蒸馏水 乙醇 甲酰胺 胶的缓冲液 亚甲基蓝 十二烷基硫酸钠储存液 TAE 缓冲液 Tris 乙酸盐 乙酸纳 EDTA 蓝色葡聚糖 TEN 缓冲液 40mer 聚丙烯酰胺胶
解剖刀 UV 灯 过滤 UV 的安全破璃
解剖刀 UV 灯 过滤 UV 的安全破璃
步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
蒸馏水
乙醇，95%
甲酰胺 (使用安珀莱特单床离子交换树脂 MB-1 除去离子，并储存在暗中）
胶的缓冲液是标准的 TBE+6mol/L 尿素
亚甲基蓝，100X，0.05%
十二烷基硫酸钠储存液，10%
TAE 缓冲液
40 mmol/LTris 乙酸盐
20 mmol/L 乙酸纳
0.2 mmol/LEDTA,pH8.3
蓝色葡聚糖，1mg/ml
TEN 缓冲液
10 mmol/LTris-HCl,pH7.9
10mmol/LNaCl
0.1 mmol/LEDTA
2. 核酸和寡核苷酸
40mer(40bp 寡核苷酸）
3. 凝胶
聚丙烯酰胺胶，其中丙烯酰胺：双丙烯酰胺的比值为 100:1(总共 12% 丙烯酰胺），胶的大小为 40 cmX20 cmX2 mm
4. 特殊设备
解剖刀
UV 灯 (UVGL-58,Ultraviolet 产品）
过滤 UV 的安全破璃
二、方法
1. 将每种 40mer 以1mmol/L 的终浓度悬浮在 TEN 缓冲液中，每个泳道（1cm 宽）仅上样1000pmol(1ul+4ul 甲酰胺）。
2. 当 40mer 迁移了约 30~35 cm 时，将胶浸泡在蒸馏水中并更换两次水，以除去尿素，然后用 0.0005% 的亚甲基蓝染色过夜。可见的蓝色条带并非准确地同步迁移，这是由于序列效应的影响，尽管它们全都是 40bP 的寡核苷酸。另一种可以选择代替染色的方法是用紫外投影的方法来检测凝胶中的条带，戴上护目镜，用手持的 UV 光源从上方照射放于普通打印纸上的胶，肢中条带的荧光要弱于周围的荧光。
3. 用新解剖刀切下每一种的最主要的条带，在 3 倍体积的 0.1% 的 SDS 和 TAE 中 37°C 浸泡 1 或 2 个晚上。回收上清液（避免胶的破碎），用 3 倍体积的乙醇沉淀。
4. 将经重新电泳、亚甲基蓝染色后的 40mer 与一些加入的未经纯化的 40mer 相比较，估计出 40mer 的产量，将其作为所有寡核苷酸的代表数据。在实验中，整个的产率约为 30%, 这一数据被采用来针对所有的寡核苷酸。
5. 将寡核苷酸汇集，并将每一种的浓度在 TEN 缓冲液中调整到
1. 缓冲液、溶液和试剂
蒸馏水
乙醇，95%
甲酰胺 (使用安珀莱特单床离子交换树脂 MB-1 除去离子，并储存在暗中）
胶的缓冲液是标准的 TBE+6mol/L 尿素
亚甲基蓝，100X，0.05%
十二烷基硫酸钠储存液，10%
TAE 缓冲液
40 mmol/LTris 乙酸盐
20 mmol/L 乙酸纳
0.2 mmol/LEDTA,pH8.3
蓝色葡聚糖，1mg/ml
TEN 缓冲液
10 mmol/LTris-HCl,pH7.9
10mmol/LNaCl
0.1 mmol/LEDTA
2. 核酸和寡核苷酸
40mer(40bp 寡核苷酸）
3. 凝胶
聚丙烯酰胺胶，其中丙烯酰胺：双丙烯酰胺的比值为 100:1(总共 12% 丙烯酰胺），胶的大小为 40 cmX20 cmX2 mm
4. 特殊设备
解剖刀
UV 灯 (UVGL-58,Ultraviolet 产品）
过滤 UV 的安全破璃
二、方法
1. 将每种 40mer 以1mmol/L 的终浓度悬浮在 TEN 缓冲液中，每个泳道（1cm 宽）仅上样1000pmol(1ul+4ul 甲酰胺）。
2. 当 40mer 迁移了约 30~35 cm 时，将胶浸泡在蒸馏水中并更换两次水，以除去尿素，然后用 0.0005% 的亚甲基蓝染色过夜。可见的蓝色条带并非准确地同步迁移，这是由于序列效应的影响，尽管它们全都是 40bP 的寡核苷酸。另一种可以选择代替染色的方法是用紫外投影的方法来检测凝胶中的条带，戴上护目镜，用手持的 UV 光源从上方照射放于普通打印纸上的胶，肢中条带的荧光要弱于周围的荧光。
3. 用新解剖刀切下每一种的最主要的条带，在 3 倍体积的 0.1% 的 SDS 和 TAE 中 37°C 浸泡 1 或 2 个晚上。回收上清液（避免胶的破碎），用 3 倍体积的乙醇沉淀。
4. 将经重新电泳、亚甲基蓝染色后的 40mer 与一些加入的未经纯化的 40mer 相比较，估计出 40mer 的产量，将其作为所有寡核苷酸的代表数据。在实验中，整个的产率约为 30%, 这一数据被采用来针对所有的寡核苷酸。
5. 将寡核苷酸汇集，并将每一种的浓度在 TEN 缓冲液中调整到
来源：丁香实验
