原理
剪接反应的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物补充 SR 蛋白或粗提取物的部分纯化组分，最常使用的是 HeLa 细胞的提取物。前体 mRNA 底物通常采用噬菌体聚合酶体外转录的方法来制备。
材料与仪器
前体 mRNA 底物
ATP CP 混合物 HEPES-KOH 聚乙烯醇 剪接终止溶液 Tris-HCl 饱和酚 RNA 上样液 丙烯酰胺-尿素凝胶储存溶液
ATP CP 混合物 HEPES-KOH 聚乙烯醇 剪接终止溶液 Tris-HCl 饱和酚 RNA 上样液 丙烯酰胺-尿素凝胶储存溶液
步骤
一、材料与设备
所有的试剂应该用高质量的高压灭菌水配制，例如 Milli Q（Millipore，Bedford，MA，USA）纯化或双蒸馏水。所有化学试剂应该是超纯级别的或专门用于分子生物学制备的级别。由于体外剪接分析涉及 1015 摩尔级的 RNA，应该特别小心，以避免核糖核酸酶污染。
1. 前体 mRNA 底物
底物由线性化质粒体外转录制备，将目的基因或它的一部分克隆到质粒的噬菌体启动子下游，通常采用的噬菌体 RNA 聚合酶是从 SP6，T7 和 T3 噬菌体中分离而来的。含有帽子结构的前体 mRNA 比不带帽的前体 mRNA 分子更加稳定，而且剪接更加有效。制备含有帽子的前体 mRNA 底物最方便和有效的方法是用二核苷酸引物（7mGpppG 或者 GpppG）进行转录。在转录反应中通常采用一种，特定情况下使用两种或多种 32P 标记的核苷酸，使转录合成的前体 mRNA 分子获得均一标记。转录的前体 mRNA 用苯酚抽提并用乙醇沉淀纯化，RNA 的产量和浓度根据放射性标记来测定，如采用三氯乙酸 ( TCA ) 沉淀法测定。由于噬菌体 RNA 聚合酶对其启动子的识别呈高度特异性，转录后通常不需凝胶纯化。但是如果特定模板产生不均一的转录物时，全长的前体 mRNA 应该用制备性变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
2. 试剂
(1) 25X ATP/CP 混合物：12.5 mmol/L ATP，0.5 mol/L 磷酸肌酸（CP）。每份分装于微量离心管中，于 -20℃ 储存。
(2) 80 mmol/L 高纯度级的 MgCl2 配制 1 mol/L 储备溶液，稀释以制备工作液，每份 0.2 ml 分装于微量离心管中，储存于 4℃ 或者 -20°C。
(3) 0.4 mol/L HEPES-KOH（pH 7.3），用 0.2 μm 过滤器过滤除菌并储存于 4°C。
(4) 13%（m/V）聚乙烯醇 ( PVA )。应选用低分子质量 PVA ( Signia，p-8136 )，为了便于溶解，用 Miili-Q 水在一个带帽的玻璃瓶中悬浮 PVA，并高压火菌 10 min，以毎份 1 ml 分装到微量离心管并储存于 -20°C。
(5) 剪接终止溶液：0.3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2)，0.1% ( m/V) SDS，62.5 μg/ml tRNA。储存于室温或 4℃。
(6) Tris-HCl 饱和酚（pH 8.0）。
(7) RNA 上样液：90%（V/V）甲酰胺，50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，1 mmol/L EDTA，0.1%（V/V）溴酚蓝，0.1% ( m/V ) 二甲苯蓝 FF。以每份 1 ml 分装在微量离心管中并储存于 -20℃。
(8) 丙烯酰胺-尿素凝胶储存溶液：19%（m/V）丙烯酰胺，1%（m/V）甲叉双丙烯酰胺，7 mol/L 尿素，89 mmol/L Tris 碱，89 mmol/L 硼酸和 2 mmol/L EDTA。将这个储备溶液用仅缺丙烯酰胺的相同溶液稀释到工作浓度（通常 4%~10% 丙烯酰胺），升温到 37℃，并且在与过硫酸铵（每 20 ml 加 10% 过硫酸铵 133 μl ) 和 TEMED ( 每 20 ml 加 10 μl）聚合之前真空脱气。所用丙烯酰胺的浓度根据所需剪接产物的大小来决定，较高的丙烯酰胺浓度可使套索 RNA（lariat RNA，RNA 剪接过程中的中间产物）分子比较长的线形前体 mRNA 分子迁移得慢，这便于中间产物和产物中套索分子的鉴定并提高灵敏度，因为套索分子的迁移率比在长时间放射自显影曝光中观察到的降解 RNA 分子的要慢。
二、操作方法
1. 体外剪接反应
(1) 在置于冰上的离心管中加入新鲜配制的剪接缓冲混合物：1.0 μl 25X ATP/CP 混合物，1.0 μl 80 mmoI/L MgCl2，1.25 μl 0.4 mol/L HEPES-KOH ( pH 7.3 )，5.0 μl 13% PVA ( 最后加），20 fml（通常 0.1~0.4 μl ）32P 标记的前体 mRNA，加 Milli-Q 水至 10 μl。13% PVA 很黏，应该最后加并用 P-20 吸头上下吹打以轻轻混合，避免产生泡沫。混匀后瞬时离心（约 3 s）。
(2) 解冻足够量的冷冻 HeLa 细胞核剪接提取物。提取物在室温下解冻并立即置于冰上，未用完的提取物可在 -70℃ 储存，反复冻融一般不会导致剪接活性丧失。
(3) 剪接反应。将实验用离心管置于冰上，小心吸取 15 μl 缓冲液 D 透析的 HeLa 细胞核提取物 ( 或者缓冲液 D 中的 S100 提取物加 SR 蛋白）。根据提取物的量和浓度，有效的剪接通常需要核提取物或者 5~10 μl 核提取物或者 5~10 μl S100 提取物加 15~20 pmol 的 SR 蛋白。加 10 μl 剪接缓冲液混合物，使用新吸头并用 P-20 吸头上下吹打（不要振荡）轻轻混合所有的试剂。
(4) 瞬时离心（大约 3 s)，并于 30℃ 温育 1~4 h。剪接效率依特定前体 mRNA 而定。
(5) 加 0.2 ml 的剪接终止溶液。
(6) 加 0.2 ml 的 Tris-饱和酚并立即振荡 1~2 min。
(7) 离心 5 min，将水相转移到一新离心管中。避免带入有机相和中间相的物质，以免造成污染。
(8) 加 0.5 ml 的乙醇并振荡。置冰上或者冷冻至少 10 min，如果需要的话可以储存过夜。
2. 变性 PAGE 分析剪接产物
15~20cmX15~20cm 的小尺寸凝胶适合于常规的剪接分析，如果要分离多种大小相近的 RNA 应使用较长的凝胶。厚度小于 0.5 mm 的薄凝胶放射自显影时条带较锐利。
(1) 将1 “体外剪接反应” 中制备的乙醇沉淀的 RNA 离心 15 min，小心去除乙醇而不要搅动沉淀。如果乙醇已彻底去除，就不用进行干燥。
(2) 加入 3~4 μl RNA 上样液，使用移液器上下吹打或振荡使 RNA 沉淀溶解。
(3) 在 80~85℃ 加热 5~10 min。
(4) 变性聚丙烯酰胺凝胶应该在加样品之前预电泳至少 30 min。在上样前用注射器清洗凝胶的加样孔以去除扩散到孔中的尿素，将加热后的样品直接（不冷却）加载到各个孔中。
(5) 电泳，直到指示剂迁移至所需距离。
(6) 电泳结朿后拆除电泳装置，在凝胶之上放张用过的 X 射线片或者 3 MM 纸，并轻轻用力使凝胶牢固地粘在上面。将玻片翻过来，慢慢从一边拿起玻片，确保凝胶粘在胶片或纸上。用干净的 X 射线片覆盖凝胶上。
(7) 放射自显影通常在 -70℃ 进行，并用增感屏。曝光时间通常从 2 h 到整夜，依 RNA 的标记活性而定。
所有的试剂应该用高质量的高压灭菌水配制，例如 Milli Q（Millipore，Bedford，MA，USA）纯化或双蒸馏水。所有化学试剂应该是超纯级别的或专门用于分子生物学制备的级别。由于体外剪接分析涉及 1015 摩尔级的 RNA，应该特别小心，以避免核糖核酸酶污染。
1. 前体 mRNA 底物
底物由线性化质粒体外转录制备，将目的基因或它的一部分克隆到质粒的噬菌体启动子下游，通常采用的噬菌体 RNA 聚合酶是从 SP6，T7 和 T3 噬菌体中分离而来的。含有帽子结构的前体 mRNA 比不带帽的前体 mRNA 分子更加稳定，而且剪接更加有效。制备含有帽子的前体 mRNA 底物最方便和有效的方法是用二核苷酸引物（7mGpppG 或者 GpppG）进行转录。在转录反应中通常采用一种，特定情况下使用两种或多种 32P 标记的核苷酸，使转录合成的前体 mRNA 分子获得均一标记。转录的前体 mRNA 用苯酚抽提并用乙醇沉淀纯化，RNA 的产量和浓度根据放射性标记来测定，如采用三氯乙酸 ( TCA ) 沉淀法测定。由于噬菌体 RNA 聚合酶对其启动子的识别呈高度特异性，转录后通常不需凝胶纯化。但是如果特定模板产生不均一的转录物时，全长的前体 mRNA 应该用制备性变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
2. 试剂
(1) 25X ATP/CP 混合物：12.5 mmol/L ATP，0.5 mol/L 磷酸肌酸（CP）。每份分装于微量离心管中，于 -20℃ 储存。
(2) 80 mmol/L 高纯度级的 MgCl2 配制 1 mol/L 储备溶液，稀释以制备工作液，每份 0.2 ml 分装于微量离心管中，储存于 4℃ 或者 -20°C。
(3) 0.4 mol/L HEPES-KOH（pH 7.3），用 0.2 μm 过滤器过滤除菌并储存于 4°C。
(4) 13%（m/V）聚乙烯醇 ( PVA )。应选用低分子质量 PVA ( Signia，p-8136 )，为了便于溶解，用 Miili-Q 水在一个带帽的玻璃瓶中悬浮 PVA，并高压火菌 10 min，以毎份 1 ml 分装到微量离心管并储存于 -20°C。
(5) 剪接终止溶液：0.3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2)，0.1% ( m/V) SDS，62.5 μg/ml tRNA。储存于室温或 4℃。
(6) Tris-HCl 饱和酚（pH 8.0）。
(7) RNA 上样液：90%（V/V）甲酰胺，50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，1 mmol/L EDTA，0.1%（V/V）溴酚蓝，0.1% ( m/V ) 二甲苯蓝 FF。以每份 1 ml 分装在微量离心管中并储存于 -20℃。
(8) 丙烯酰胺-尿素凝胶储存溶液：19%（m/V）丙烯酰胺，1%（m/V）甲叉双丙烯酰胺，7 mol/L 尿素，89 mmol/L Tris 碱，89 mmol/L 硼酸和 2 mmol/L EDTA。将这个储备溶液用仅缺丙烯酰胺的相同溶液稀释到工作浓度（通常 4%~10% 丙烯酰胺），升温到 37℃，并且在与过硫酸铵（每 20 ml 加 10% 过硫酸铵 133 μl ) 和 TEMED ( 每 20 ml 加 10 μl）聚合之前真空脱气。所用丙烯酰胺的浓度根据所需剪接产物的大小来决定，较高的丙烯酰胺浓度可使套索 RNA（lariat RNA，RNA 剪接过程中的中间产物）分子比较长的线形前体 mRNA 分子迁移得慢，这便于中间产物和产物中套索分子的鉴定并提高灵敏度，因为套索分子的迁移率比在长时间放射自显影曝光中观察到的降解 RNA 分子的要慢。
二、操作方法
1. 体外剪接反应
(1) 在置于冰上的离心管中加入新鲜配制的剪接缓冲混合物：1.0 μl 25X ATP/CP 混合物，1.0 μl 80 mmoI/L MgCl2，1.25 μl 0.4 mol/L HEPES-KOH ( pH 7.3 )，5.0 μl 13% PVA ( 最后加），20 fml（通常 0.1~0.4 μl ）32P 标记的前体 mRNA，加 Milli-Q 水至 10 μl。13% PVA 很黏，应该最后加并用 P-20 吸头上下吹打以轻轻混合，避免产生泡沫。混匀后瞬时离心（约 3 s）。
(2) 解冻足够量的冷冻 HeLa 细胞核剪接提取物。提取物在室温下解冻并立即置于冰上，未用完的提取物可在 -70℃ 储存，反复冻融一般不会导致剪接活性丧失。
(3) 剪接反应。将实验用离心管置于冰上，小心吸取 15 μl 缓冲液 D 透析的 HeLa 细胞核提取物 ( 或者缓冲液 D 中的 S100 提取物加 SR 蛋白）。根据提取物的量和浓度，有效的剪接通常需要核提取物或者 5~10 μl 核提取物或者 5~10 μl S100 提取物加 15~20 pmol 的 SR 蛋白。加 10 μl 剪接缓冲液混合物，使用新吸头并用 P-20 吸头上下吹打（不要振荡）轻轻混合所有的试剂。
(4) 瞬时离心（大约 3 s)，并于 30℃ 温育 1~4 h。剪接效率依特定前体 mRNA 而定。
(5) 加 0.2 ml 的剪接终止溶液。
(6) 加 0.2 ml 的 Tris-饱和酚并立即振荡 1~2 min。
(7) 离心 5 min，将水相转移到一新离心管中。避免带入有机相和中间相的物质，以免造成污染。
(8) 加 0.5 ml 的乙醇并振荡。置冰上或者冷冻至少 10 min，如果需要的话可以储存过夜。
2. 变性 PAGE 分析剪接产物
15~20cmX15~20cm 的小尺寸凝胶适合于常规的剪接分析，如果要分离多种大小相近的 RNA 应使用较长的凝胶。厚度小于 0.5 mm 的薄凝胶放射自显影时条带较锐利。
(1) 将1 “体外剪接反应” 中制备的乙醇沉淀的 RNA 离心 15 min，小心去除乙醇而不要搅动沉淀。如果乙醇已彻底去除，就不用进行干燥。
(2) 加入 3~4 μl RNA 上样液，使用移液器上下吹打或振荡使 RNA 沉淀溶解。
(3) 在 80~85℃ 加热 5~10 min。
(4) 变性聚丙烯酰胺凝胶应该在加样品之前预电泳至少 30 min。在上样前用注射器清洗凝胶的加样孔以去除扩散到孔中的尿素，将加热后的样品直接（不冷却）加载到各个孔中。
(5) 电泳，直到指示剂迁移至所需距离。
(6) 电泳结朿后拆除电泳装置，在凝胶之上放张用过的 X 射线片或者 3 MM 纸，并轻轻用力使凝胶牢固地粘在上面。将玻片翻过来，慢慢从一边拿起玻片，确保凝胶粘在胶片或纸上。用干净的 X 射线片覆盖凝胶上。
(7) 放射自显影通常在 -70℃ 进行，并用增感屏。曝光时间通常从 2 h 到整夜，依 RNA 的标记活性而定。
来源：丁香实验
