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方案27.10 细胞杂交

相关实验: 细胞杂交

最新修订时间:

材料与仪器

PEG
完全培养基 无血清培养基 NaOH
皮氏培养皿 通用容器

步骤

PEG 1000 ( Merck):

(a) 髙压处理PEG,将其液化及灭菌。

(b) 将 PEG 冷却到 37°C ,然后与预热至 37°C 的等体积无血清培养基混合。

(c) 用 1.0 mol/L NaOH 调整 pH 至约 7.6~7.9。

(d) 溶液于 4°C 储存最长为2 周。

A. 单层培养细胞的融合:

1. 将两种等量待融合的细胞分别接种于 50 mm 细胞培养皿。每个亲代细胞系接种浓度在 2.5X105~2.5X 106 /皿之间即可。

2. 将混合的细胞过夜培养。

3. 将 PEG-无血清培养基加温至 37°C ,此时需要用 NaOH 重新调定 pH。

4. 弃净原培养液,用无血清培养基洗涤细胞一次。

5. 加入 3.0 ml PEG 溶液,使其覆盖单层细胞。

6. 精确计时 1 min,之后弃去 PEG,用 10 ml 无血清培养基洗涤单层细胞,改换完全培养基。

7. 过夜培养细胞。

8. 再加入选择性培养基。

B. 悬浮培养细胞的融合:

9. 将两种亲代细胞混合(各为 4X106 个细胞),室温、150g 离心 5 min。后续离心和融合过程均在 30 ml 的塑料通用容器或离心管中进行。

10. 用 15 ml 无血清培养基将沉淀制成悬浮液,再次离心。

11. 吸去所有的培养基。

12. 用吸管小心加入 1 ml PEG 溶液,轻轻吹打,悬浮细胞。

13. 1 min 后,用 9 ml 无血淸培养基将细胞悬液稀释,将其等分到 2 个通用容器或 1 个预盛 15 ml 无血清培养基的离心管中。

14. 以 150 g 离心 5 min,弃去上清,用完全培养基再次悬浮细胞。

15. 37°C 过夜培养。

16. 在选择性培养基中克隆细胞。

来源:丁香实验

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