从革兰氏阳性菌中分离RNA

10 ml 细菌培养物
DEPC 处理的水 裂解缓冲液 酚 氯仿 异戊醇 5mol LNaCl 冰冷的无水乙醇 70% 乙醇 DNA 酶消化缓冲液 TE 缓冲液
离心机 带微探头的超声仪

一 材料与设备

1)10 ml 细菌培养物，

2)DEPC 处理的水。

3) 裂解缓冲液：30 mmol/LTris-Cl(PH7.4)，100 mmol/LNaCl，5 mmol/LEDTA，1%(M/V)SDS, 使用前加蛋白酶 K 至 100ug/ml

4) 酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1), 酚用 Tris-Cl(pH8.0) 平衡

5)24:1 氯仿：异戊醇

6)5mol/LNaCl。

7) 冰冷的无水乙醇和 70% 乙醇。

8)DNA 酶消化缓冲液：20 mmol/LTris-Cl(pH8.0),10 mmol/LMgCI2，2.5 mg/ml无 RNA 酶的 DNA 酶

9)TE 缓冲液 (PH8.0)。

10) 离心机。

11) 带微探头的超声仪，

二 操作方法

1) 于 4℃12000 g 离心，从 10 ml 细阐培养物中回收细胞，重悬菌体于 0.5 ml 裂解缓冲液，并移入微量离心管中，在干冰屮冻结

2) 解冻并用微探头超声仪以 30W 超声 3 次，每次 l0S，避免起泡，37℃ 温育 6Omin。

3) 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1) 抽提，于室温用微量离心机高速离心 3 min，上层水相移入另一干净微量离心管中。

4) 用酚：氯仿：异戊醇（25：24:1) 再抽提 1 次，再用氯仿：异戊醇（24:1) 抽提 1次。

5)400ul 水相加入 15ul 5mol/LNaCl，并加满冰冷的无水乙醇，混匀并于冰上放置 15〜30 min 或于-20℃ 过夜

6）于 4℃ 用微量离心机离心 15 min 沉淀用冰冷的 70% 乙醇冲洗，晾干，用 95ul DMA 酶消化缓冲液溶解沉淀，加 4ul 2.5 mg/ml 无 RNA 酶的 DNA 酶 I，37℃ 温育60 min

7) 用酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1) 抽提 1 次，移出水相，有机相加入 100ulTE 冲液，混匀，于室温下用微暈离心机高速离心5min，合并两次的水相。

8) 用氯仿：异戊醇（24:1) 抽提 1 次，加入 10ul 5mol/L NaCl 和 60ul 无水乙醇，在20°C 过夜或置于干冰/乙醇中 15 min 用微量离心机于 4℃ 下高速离心 15〜30 min

9) 用 500ul70% 乙醇洗涤沉淀，晾干。溶解于 100ulDEPC 处理过的水。取 10UL 稀释于 lml 水. 测 A₂₆₀ 和 A₂₈₀ 以定量 RNA, 保存于-70℃ 或以乙醇沉淀的形式保存。