原理
将同位素标记探针与固定于显微镜载玻片上的细胞进行杂交，然后通过放射自显影将杂交位点显影。
材料与仪器
糖原 琼脂糖 二硫苏糖醇 二硫苏糖醇
焦碳酸二乙酯 DEPC-水 酚-氯仿-异戊醇 乙酸钠 无水乙醇 层析柱流动相缓冲液 苯酚 氯仿-界戊醇 闪烁液 组织洗涤液 NaCl-DEPC EDTA 蛋白酶K缓冲液 蛋白酶K储存液 甲醛 三乙醇胺 冰乙酸 DTT 杂交液 明胶 RNaseA储存液 RNase缓冲液 β-巯基乙醇 50%甲醛 SSC
微量离心管 微量离心机 RNA标记试剂盒 G50葡聚糖凝胶层析柱
焦碳酸二乙酯 DEPC-水 酚-氯仿-异戊醇 乙酸钠 无水乙醇 层析柱流动相缓冲液 苯酚 氯仿-界戊醇 闪烁液 组织洗涤液 NaCl-DEPC EDTA 蛋白酶K缓冲液 蛋白酶K储存液 甲醛 三乙醇胺 冰乙酸 DTT 杂交液 明胶 RNaseA储存液 RNase缓冲液 β-巯基乙醇 50%甲醛 SSC
微量离心管 微量离心机 RNA标记试剂盒 G50葡聚糖凝胶层析柱
步骤
RNA 的制备
制备探针的所有溶液以及杂交后的洗脱液都必须无 RNA 酶。溶液需经 DEPC 处理，于 121°C 高压灭菌 20 min。虽然这一过程可以清除绝大部分 RNA 酶，但由于天然 RNA 酶存在广泛，即使小心操作，也不能保证玻璃器皿和吸头上残留的 RNA 酶被彻底清除。因此进行 RNA 操作时，需要单独使用一套吸头，用前以 DEPC 水常规过夜浸泡，或用相应的 RNA 酶抑制剂处理，如 RNase-Zap ( Ambion)；所有的玻璃器皿要用铝箔包裹好，使用前要经高压灭菌处理；Eppendorf 离心管应用 DEPC 水或 RNase-Zap 处理，然后高压灭菌。
探针制备
RNA探针（核糖体探针〉
制备 RNA 探针需要一条与靶序列对应的 DNA 链为模板，通过放射性核苷酸掺入，生成正义及反义 RNA 探针。
如果需要制备高活性探针，理想的选择是单链 RNA 探针；通常探针长度为 200~1000 个碱基对（bp )，但最适长度为 150~200 bp，因为标记的探针越长，其组织穿透力越弱。如果需要，可用有限碱性水解反应来缩短探针长度。RNA-RNA 或 RNA-DNA 杂交链比寡核苷酸-寡核苷酸及 DNA-DNA 杂交链更为稳定，因此使用前两者作为探针最常见。
商品化探针及对照探针
商品化的肌动蛋白（actin ) 和三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH ) 的 DNA 模板可以用来制备 RNA 探针，由于这两种基因同属管家基因，且在真核细胞中普遍表达，故常用作阳性对照。阴性对照常采用正义链探针，使用阴性对照可以排除假阳性，所得结果更为准确。在每次杂交的载玻片上，还应该加载一个组织类型明确、具有特定 RNA 表达谱的肿瘤标本，作为阳性样本对照，用以客观评价杂交结果。这些阳性对照标本已商品化，可从相关的生物公司购得。
质粒 DNA 的线性化
1. 向每个微量离心管中加入 10~20 μg DNA。
2. 每微克 DNA 中加 10 单位限制性内切酶，按产品说明书进行酶切消化。
3. 37°C 条件下消化 3 h 或过夜消化。
酚/氯仿抽提
4. 加入 400 μl 酚-氯仿-异戊醇（pH 8.0 )，旋涡振荡混匀。
5. 室温下 13 000 rpm 离心 3 min。
6. 收集上清，将其移入新管中，加入 10 μl 的 NaAc (3 mol/L，pH 8 ) 。
7. 加入 250 μl 100% 乙醇（保藏于 -20°C )。
8. 加入 1 μl 糖原，用于促进 DNA 沉淀。
9. 将离心管置于干冰上 1 h 。
10. 13 000 rpm 离心 15 min。
11. 弃去上清，保留沉淀。
12. 加入 400 μl 70% 乙醇（保藏于 -20°C）洗涤沉淀。
13. 13 000 rpm 离心 10 min。
14. 弃去 70% 的乙醇，将沉淀在室温下晾干。
15. 依据 DNA 的使用量，用 10~20 μl DEPC 水再次溶解（见步骤 1 )，制成终浓度 1 μg DNA /μl 为宜。
16. 取 0.5 μl DNA 样本液，用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳。
RNA标记
涉及放射性核苷酸掺入的操作方法，请参考 Amersham 试剂盒（RPN3100；Amersham Biosciences ) 附带说明，步骤如下：
1. 在一个微量离心管中混合以下成分
(a)4 μl 5× 转录缓冲液，
(b)1 μl 0.2 mol/L DTT，
(c)1 μl HPRI，
(d)0.5 μl ATP、CTP 及 GTP，
(e)1 μl 线性 DNA 模板（1 μg/ml )，
(f)9.5 μl 35S-UTP，
(g)2 μl RNA 聚合酶。
2. 混匀各成分，并将溶液置于 37℃，1.5 h
DNA 酶法提取 DNA 模板
3. 加入 10 U DNase I 。
4. 加入 RNase 抑制剂 1 μl。
5. 将溶液混匀，37°C 放置 10 min。
去除未掺入的核苷酸
6. 用 2 ml 柱缓冲液平衡 G50 葡聚糖层析柱。
7. 将探针上柱。
8. 加入 400 μl 的层析柱缓冲液洗脱，静置使洗脱液全部流出，弃掉。
9. 再加入 400 μl 的层析柱缓冲液，用 Eppendorf 离心管收集洗脱液。
酚/ 氯仿抽提
10. 向 Eppendorf 离心管的收集液中加入 400 μl 酚（pH 5.0 ) ，旋涡振荡混匀，13 000 rpm 离心 3 min。
11. 收集上清液，移至一个新的微量离心管中，向其加入 400 μl 氯仿-异戊醇，旋涡振荡混匀 13 000 rpm 离心 3 min。
12. 收集上清液，取 1 μl 的上清液测定掺入量。
13. 剩余的上清液加入 2.5 倍体积的 -20℃ 冰冻 100% 乙醇。
14. 加入 1 μl 的酵母糖原，以促进沉淀。
15. 将 Eppendorf 管置于空气中晾干，30 min。
16. 13 000 rpm 离心 15 min。
17. 吸去残留的乙醇，切勿触及沉淀。
18. 用 70% 乙醇洗涤沉淀物，再以 13 000 rpm 离心 10 min，然后弃去乙醇。
19. 晾干沉淀，而后用 50 mmol/L DTT 再次悬浮（制成悬液），用以下方法计算应加 50 mmol/L DTT 的体积：
(a)取步骤 12 得到的上清液 1 μl，加 2~3 ml 闪烁液，并在液闪计数仪上测定每分钟闪烁次数（CPM )
(b) DTT 体积= CPM × 400 ÷ （6×105）
公式中的 400 是在加入酚/氯仿抽提液后的体积，6×105 是在 DTT 溶液中测得的总 CPM 值。
(c)据此得出 50 mmol/L DTT 所应加的体积。
20. 取出 1 μl 溶液，然后再次计数 CPM，以确认探针的比活性。
原位杂交
标本的制备
下述操作步骤的目的在于保持组织结构和形态的完整，不破坏细胞 RNA。用快速冷冻或福尔马林固定等方法处理组织样本，可以避免 RNA 降解。而使用 4 % 的多聚甲醛及 4 % 的甲醛等交联固定液固定，既可保全 RNA，又不影响 RNA 的特异性结合，不失为首选。组织的固定时间取决于样品的大小。固定的时间越长，组织的形态保持就越好，但是这也会降低与探针的结合力。石蜡可作为包埋剂，经过石蜡包埋的标本可切成厚度为 1 μm 的薄片，且很容易在杂交前脱蜡。由于石蜡切片还需多种溶液的后续处理，建议使用包被玻片，以保证样品不被滑落。冰冻样品应冷却到 -70°C 再进行切片，冰冻切片需放置在包被玻片上进行固定。
杂交前的组织制备
杂交前，进行如下处理的目的在于，增加 RNA 靶序列与探针的亲和力、降低非特异背景。经蛋白酶处理的样品，其靶核苷酸与探针的亲和力会相应提高，特别是当探针长度大于 100 bp 时。为了抑制组织蜕变，必须用甲醛对样品进行后固定处理，这一点十分重要。应用冰乙酸进行乙酰基化处理，可降低由于结合蛋白氨基端而产生非特异性背景。在组织制备过程中，要高度重视 RNA 酶的降解作用。为了去除任何可能的污染，所有玻璃制品和溶液必须分别进行无菌消毒和 DEPC 处理。
整个操作中都必须戴手套。要尽量减少触摸组织切片的机会。
杂交
对于某些探针/靶序列能否稳定结合，杂交温度非常关键。福尔马林虽说是一种螺旋链的去稳定剂，但杂交缓冲液中如果加入福尔马林，会降低杂交链的解链温度，使杂交过程有可能在一个温度较低的环境中进行。杂交温度越低，对于维持组织的结构越有利。至今，研究发现最适温度为 52°C 。在杂交缓冲液中加入硫酸右旋糖酐可相应减少杂交体积、增加探针浓度、缩短杂交时间。尽管杂交反应在 5~6 h 内可基木完成，但是通常都采用过夜杂交。在杂交缓冲液加入适当的钠离子会起到稳定杂交体系的作用。
杂交后的洗脱
杂交后洗脱的主要目的在于通过选择不同的温度、盐浓度、甲酰胺浓度来去除未结合的或非特异性结合的探针。可采用 RNA 酶来消化单链 RNA 及未结合的靶序列，但是它不会降解已经结合的 RNA-RNA 复合物。
石蜡切片的预处理
1. 用组织洗涤液（Histoclear ) 对石蜡切片进行 2 次脱蜡，共 10 min。
2. 用梯度浓度（100%、90% 、70% 、50% 、30% ) 乙醇进行再水合，每次 10 s。
3. 用 0. 85% NaCl 及 D-PBSA 溶液分别淋洗 5 min。
4. 将组织切片置于 200 ml 蛋白酶 K 缓冲液中（由 400 μl 蛋白酶 K 储存液稀释而成），消化 7.5 min。
5. 用 D-PBSA 淋洗 3 min。
6. 用 4% 甲醛或 4% 多聚甲醛进行后固定。
7. 用 DEPO 水淋洗 1 min。
8. 在通风橱中，用 0.1 mol/L 的 200 ml 三乙醇胺（含 500 μl 冰乙酸）溶液对切片进行乙酰化处理 10 min，期间不断充分搅拌。
9. 以 D-PBSA 及 0.85% NaCl 分别淋洗 5 min。
10. 在梯度浓度（30% 、50% 、70% 、90% 、100% ) 乙醇中进行脱水，各 10 s。
11. 将切片晾干。
探针的制备及杂交
12. 分别取 1 mol/L DTT 16 μl，60% 杂交液（Hybridmix ) 344 μl 及探针 40 μl，混合，旋涡振荡混匀，离心片刻，该混合液可供 20 张石蜡切片杂交。
13. 将探针于 80°C 变性 3 min，之后于冰上冷却。
14. 各取 20 μl 步骤 12 的探针混合液，分别滴入到 20 张组织切片上，用玻璃盖玻片盖片。
15. 于温度为 52°C 的饱和湿度孵箱内过夜杂交。
杂交后的洗脱
16. 将洗脱液预热到所需温度。
17. 50°C 条件下，用 200 ml 洗脱液（含 250 μl β-巯基乙醇的 5×SSC ) 淋洗切片 30 min。
18. 65°C 条件下，用 200 ml 洗脱液（含 50% 甲酰胺和 1.4 ml β-巯基乙醇的 2×SSC ) 淋洗 20 min。
19. 37°C 条件下，用 200 ml RNase 缓冲液淋洗 2 次，每次 10 min。
20. 37°C 条件下，用 200 ml RNaseA 缓冲液（含 400 μl RNaseA ) 淋洗 30 min。
21. 重复步骤 19，改为每次淋洗 15 min。
22. 重复步骤 18。
23. 50°C 条件下，依次用 200 ml 5×SSC 及 200 ml 0.1×SSC 淋洗，各 15 min。
24. 在一组不同浓度（50% 、70% 、100% ) 的乙醇中脱水，各 1 min。
25. 晾干切片。
26. 在明胶溶液中浸泡载玻片 1 min，然后风干。
放射自显影
详见方案 27. 3 。
制备探针的所有溶液以及杂交后的洗脱液都必须无 RNA 酶。溶液需经 DEPC 处理，于 121°C 高压灭菌 20 min。虽然这一过程可以清除绝大部分 RNA 酶，但由于天然 RNA 酶存在广泛，即使小心操作，也不能保证玻璃器皿和吸头上残留的 RNA 酶被彻底清除。因此进行 RNA 操作时，需要单独使用一套吸头，用前以 DEPC 水常规过夜浸泡，或用相应的 RNA 酶抑制剂处理，如 RNase-Zap ( Ambion)；所有的玻璃器皿要用铝箔包裹好，使用前要经高压灭菌处理；Eppendorf 离心管应用 DEPC 水或 RNase-Zap 处理，然后高压灭菌。
探针制备
RNA探针（核糖体探针〉
制备 RNA 探针需要一条与靶序列对应的 DNA 链为模板，通过放射性核苷酸掺入，生成正义及反义 RNA 探针。
如果需要制备高活性探针，理想的选择是单链 RNA 探针；通常探针长度为 200~1000 个碱基对（bp )，但最适长度为 150~200 bp，因为标记的探针越长，其组织穿透力越弱。如果需要，可用有限碱性水解反应来缩短探针长度。RNA-RNA 或 RNA-DNA 杂交链比寡核苷酸-寡核苷酸及 DNA-DNA 杂交链更为稳定，因此使用前两者作为探针最常见。
商品化探针及对照探针
商品化的肌动蛋白（actin ) 和三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH ) 的 DNA 模板可以用来制备 RNA 探针，由于这两种基因同属管家基因，且在真核细胞中普遍表达，故常用作阳性对照。阴性对照常采用正义链探针，使用阴性对照可以排除假阳性，所得结果更为准确。在每次杂交的载玻片上，还应该加载一个组织类型明确、具有特定 RNA 表达谱的肿瘤标本，作为阳性样本对照，用以客观评价杂交结果。这些阳性对照标本已商品化，可从相关的生物公司购得。
质粒 DNA 的线性化
1. 向每个微量离心管中加入 10~20 μg DNA。
2. 每微克 DNA 中加 10 单位限制性内切酶，按产品说明书进行酶切消化。
3. 37°C 条件下消化 3 h 或过夜消化。
酚/氯仿抽提
4. 加入 400 μl 酚-氯仿-异戊醇（pH 8.0 )，旋涡振荡混匀。
5. 室温下 13 000 rpm 离心 3 min。
6. 收集上清，将其移入新管中，加入 10 μl 的 NaAc (3 mol/L，pH 8 ) 。
7. 加入 250 μl 100% 乙醇（保藏于 -20°C )。
8. 加入 1 μl 糖原，用于促进 DNA 沉淀。
9. 将离心管置于干冰上 1 h 。
10. 13 000 rpm 离心 15 min。
11. 弃去上清，保留沉淀。
12. 加入 400 μl 70% 乙醇（保藏于 -20°C）洗涤沉淀。
13. 13 000 rpm 离心 10 min。
14. 弃去 70% 的乙醇，将沉淀在室温下晾干。
15. 依据 DNA 的使用量，用 10~20 μl DEPC 水再次溶解（见步骤 1 )，制成终浓度 1 μg DNA /μl 为宜。
16. 取 0.5 μl DNA 样本液，用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳。
RNA标记
涉及放射性核苷酸掺入的操作方法，请参考 Amersham 试剂盒（RPN3100；Amersham Biosciences ) 附带说明，步骤如下：
1. 在一个微量离心管中混合以下成分
(a)4 μl 5× 转录缓冲液，
(b)1 μl 0.2 mol/L DTT，
(c)1 μl HPRI，
(d)0.5 μl ATP、CTP 及 GTP，
(e)1 μl 线性 DNA 模板（1 μg/ml )，
(f)9.5 μl 35S-UTP，
(g)2 μl RNA 聚合酶。
2. 混匀各成分，并将溶液置于 37℃，1.5 h
DNA 酶法提取 DNA 模板
3. 加入 10 U DNase I 。
4. 加入 RNase 抑制剂 1 μl。
5. 将溶液混匀，37°C 放置 10 min。
去除未掺入的核苷酸
6. 用 2 ml 柱缓冲液平衡 G50 葡聚糖层析柱。
7. 将探针上柱。
8. 加入 400 μl 的层析柱缓冲液洗脱，静置使洗脱液全部流出，弃掉。
9. 再加入 400 μl 的层析柱缓冲液，用 Eppendorf 离心管收集洗脱液。
酚/ 氯仿抽提
10. 向 Eppendorf 离心管的收集液中加入 400 μl 酚（pH 5.0 ) ，旋涡振荡混匀，13 000 rpm 离心 3 min。
11. 收集上清液，移至一个新的微量离心管中，向其加入 400 μl 氯仿-异戊醇，旋涡振荡混匀 13 000 rpm 离心 3 min。
12. 收集上清液，取 1 μl 的上清液测定掺入量。
13. 剩余的上清液加入 2.5 倍体积的 -20℃ 冰冻 100% 乙醇。
14. 加入 1 μl 的酵母糖原，以促进沉淀。
15. 将 Eppendorf 管置于空气中晾干，30 min。
16. 13 000 rpm 离心 15 min。
17. 吸去残留的乙醇，切勿触及沉淀。
18. 用 70% 乙醇洗涤沉淀物，再以 13 000 rpm 离心 10 min，然后弃去乙醇。
19. 晾干沉淀，而后用 50 mmol/L DTT 再次悬浮（制成悬液），用以下方法计算应加 50 mmol/L DTT 的体积：
(a)取步骤 12 得到的上清液 1 μl，加 2~3 ml 闪烁液，并在液闪计数仪上测定每分钟闪烁次数（CPM )
(b) DTT 体积= CPM × 400 ÷ （6×105）
公式中的 400 是在加入酚/氯仿抽提液后的体积，6×105 是在 DTT 溶液中测得的总 CPM 值。
(c)据此得出 50 mmol/L DTT 所应加的体积。
20. 取出 1 μl 溶液，然后再次计数 CPM，以确认探针的比活性。
原位杂交
标本的制备
下述操作步骤的目的在于保持组织结构和形态的完整，不破坏细胞 RNA。用快速冷冻或福尔马林固定等方法处理组织样本，可以避免 RNA 降解。而使用 4 % 的多聚甲醛及 4 % 的甲醛等交联固定液固定，既可保全 RNA，又不影响 RNA 的特异性结合，不失为首选。组织的固定时间取决于样品的大小。固定的时间越长，组织的形态保持就越好，但是这也会降低与探针的结合力。石蜡可作为包埋剂，经过石蜡包埋的标本可切成厚度为 1 μm 的薄片，且很容易在杂交前脱蜡。由于石蜡切片还需多种溶液的后续处理，建议使用包被玻片，以保证样品不被滑落。冰冻样品应冷却到 -70°C 再进行切片，冰冻切片需放置在包被玻片上进行固定。
杂交前的组织制备
杂交前，进行如下处理的目的在于，增加 RNA 靶序列与探针的亲和力、降低非特异背景。经蛋白酶处理的样品，其靶核苷酸与探针的亲和力会相应提高，特别是当探针长度大于 100 bp 时。为了抑制组织蜕变，必须用甲醛对样品进行后固定处理，这一点十分重要。应用冰乙酸进行乙酰基化处理，可降低由于结合蛋白氨基端而产生非特异性背景。在组织制备过程中，要高度重视 RNA 酶的降解作用。为了去除任何可能的污染，所有玻璃制品和溶液必须分别进行无菌消毒和 DEPC 处理。
整个操作中都必须戴手套。要尽量减少触摸组织切片的机会。
杂交
对于某些探针/靶序列能否稳定结合，杂交温度非常关键。福尔马林虽说是一种螺旋链的去稳定剂，但杂交缓冲液中如果加入福尔马林，会降低杂交链的解链温度，使杂交过程有可能在一个温度较低的环境中进行。杂交温度越低，对于维持组织的结构越有利。至今，研究发现最适温度为 52°C 。在杂交缓冲液中加入硫酸右旋糖酐可相应减少杂交体积、增加探针浓度、缩短杂交时间。尽管杂交反应在 5~6 h 内可基木完成，但是通常都采用过夜杂交。在杂交缓冲液加入适当的钠离子会起到稳定杂交体系的作用。
杂交后的洗脱
杂交后洗脱的主要目的在于通过选择不同的温度、盐浓度、甲酰胺浓度来去除未结合的或非特异性结合的探针。可采用 RNA 酶来消化单链 RNA 及未结合的靶序列，但是它不会降解已经结合的 RNA-RNA 复合物。
石蜡切片的预处理
1. 用组织洗涤液（Histoclear ) 对石蜡切片进行 2 次脱蜡，共 10 min。
2. 用梯度浓度（100%、90% 、70% 、50% 、30% ) 乙醇进行再水合，每次 10 s。
3. 用 0. 85% NaCl 及 D-PBSA 溶液分别淋洗 5 min。
4. 将组织切片置于 200 ml 蛋白酶 K 缓冲液中（由 400 μl 蛋白酶 K 储存液稀释而成），消化 7.5 min。
5. 用 D-PBSA 淋洗 3 min。
6. 用 4% 甲醛或 4% 多聚甲醛进行后固定。
7. 用 DEPO 水淋洗 1 min。
8. 在通风橱中，用 0.1 mol/L 的 200 ml 三乙醇胺（含 500 μl 冰乙酸）溶液对切片进行乙酰化处理 10 min，期间不断充分搅拌。
9. 以 D-PBSA 及 0.85% NaCl 分别淋洗 5 min。
10. 在梯度浓度（30% 、50% 、70% 、90% 、100% ) 乙醇中进行脱水，各 10 s。
11. 将切片晾干。
探针的制备及杂交
12. 分别取 1 mol/L DTT 16 μl，60% 杂交液（Hybridmix ) 344 μl 及探针 40 μl，混合，旋涡振荡混匀，离心片刻，该混合液可供 20 张石蜡切片杂交。
13. 将探针于 80°C 变性 3 min，之后于冰上冷却。
14. 各取 20 μl 步骤 12 的探针混合液，分别滴入到 20 张组织切片上，用玻璃盖玻片盖片。
15. 于温度为 52°C 的饱和湿度孵箱内过夜杂交。
杂交后的洗脱
16. 将洗脱液预热到所需温度。
17. 50°C 条件下，用 200 ml 洗脱液（含 250 μl β-巯基乙醇的 5×SSC ) 淋洗切片 30 min。
18. 65°C 条件下，用 200 ml 洗脱液（含 50% 甲酰胺和 1.4 ml β-巯基乙醇的 2×SSC ) 淋洗 20 min。
19. 37°C 条件下，用 200 ml RNase 缓冲液淋洗 2 次，每次 10 min。
20. 37°C 条件下，用 200 ml RNaseA 缓冲液（含 400 μl RNaseA ) 淋洗 30 min。
21. 重复步骤 19，改为每次淋洗 15 min。
22. 重复步骤 18。
23. 50°C 条件下，依次用 200 ml 5×SSC 及 200 ml 0.1×SSC 淋洗，各 15 min。
24. 在一组不同浓度（50% 、70% 、100% ) 的乙醇中脱水，各 1 min。
25. 晾干切片。
26. 在明胶溶液中浸泡载玻片 1 min，然后风干。
放射自显影
详见方案 27. 3 。
来源：丁香实验
