原理
小规模培养细胞，然后将细胞加人预温和预充有 5% CO2 的培养液抽吸瓶中。利用喷射法缓慢搅拌细胞悬液直至达到所需的细胞浓度，然后收集细胞。
材料与仪器
D-PBSA 二氧化碳
抗泡沫剂
发酵培养瓶 生长培养基 内流式无菌微孔滤膜 磁铁搅拌子 电子细胞计数器或血细胞计数板
抗泡沫剂
发酵培养瓶 生长培养基 内流式无菌微孔滤膜 磁铁搅拌子 电子细胞计数器或血细胞计数板
步骤
安装大搅拌瓶（Bellco，Techne）
(a)裹在玻璃摆内的磁铁或在顶盖（如 Techne）悬挂适合于替换的搅拌子
(b)1 个带有可移动 CO2 通透盖（即有完整微孔滤膜的盖）的入口，或者有硅酮横隔的盖，盖上插入 1 根粗孔针，通过 Luer 连接管将其同定到无菌的内流式滤器（如 Millex ) 上。
(c)第 2 个进入孔，带有气流管（如 Bellco # 1965)，管的内径为 2~3 mm，这个管几乎到达瓶的底部，但要保持搅拌时不与摆接触。外部入口与由铝箔保护的柔软 Luer 管相连。
(d)全部安装完毕后，在 100 kPa ( 15 lb/in2 ) 压力下，用高压灭菌器将搅拌培养瓶消毒 20 min。但 CO2 通气盖要卸下来，分别灭菌。
1. 用 200 ml 培养液建立起始培养（见方案 13.3 )，按 5x104~1x105 个/ml 的密度接种细胞。将培养物放在磁力搅拌器上，以 60 rpm 搅拌，直至培养细胞密度达到 5x105~1x106 个/ml（注意：因细胞可发生凋亡，细胞密度不要超过 1x106 个/ml）。
2. 如图安装大搅拌瓶。
3. 向瓶内加入 4 L 培养液。
4. 用可处理的滴管或注射器向瓶内加入 0.4 ml 抗泡沫剂。
5. 用 CO2 通气盖关闭侧臂孔。
6. 将瓶放在磁力搅拌器上，置于 37℃暖房或培养箱中。
7. 通过无菌的微孔内流式滤膜，将 5% CO2 通气管连到气体入口的 Luer 管上。
8. 以 10~15 ml/min 的流速开放气体。
9. 以 60 rpm 搅拌培养液。 .
10. 将大搅拌瓶孵育 2 h ，使温度和 CO2 张力达到平衡。
11. 关闭 CO2，将瓶与 CO2 管断开。
12. 将大搅拌瓶和起始培养细胞一起带回层流通风橱。
13. 将起始细胞缓慢地一次倒入大搅拌瓶中。
14. 将大搅拌瓶放回 37℃ 培养箱或暖房中。
15. 以 60 rpm 重新开始搅拌。
16. 再连通 5% CO2 通气管，将气流调整至 10~15 ml/min（如果通气管上没有流量表，可通过计数气泡估计流速）。
17. 将细胞培养 4~7 天，每天取样检査细胞增长率。
(a)将搅拌瓶带回层流通风橱。
(b)移去侧臂盖。
(c)吸取 5~10 ml 细胞悬液。
(d)计数细胞，通过染色排斥实验检査细胞的存活能力。
18. 当细胞浓度达到所需水平
(a)关闭通气管和磁力搅拌器。
(b)中断搅拌瓶的气体供应。
(c)把搅拌瓶带到实验室，将细胞注入离心培养瓶。
(d)离心（100 g，10 min )，按照用途收集细胞（从小滴）或上淸液。
(a)裹在玻璃摆内的磁铁或在顶盖（如 Techne）悬挂适合于替换的搅拌子
(b)1 个带有可移动 CO2 通透盖（即有完整微孔滤膜的盖）的入口，或者有硅酮横隔的盖，盖上插入 1 根粗孔针，通过 Luer 连接管将其同定到无菌的内流式滤器（如 Millex ) 上。
(c)第 2 个进入孔，带有气流管（如 Bellco # 1965)，管的内径为 2~3 mm，这个管几乎到达瓶的底部，但要保持搅拌时不与摆接触。外部入口与由铝箔保护的柔软 Luer 管相连。
(d)全部安装完毕后，在 100 kPa ( 15 lb/in2 ) 压力下，用高压灭菌器将搅拌培养瓶消毒 20 min。但 CO2 通气盖要卸下来，分别灭菌。
1. 用 200 ml 培养液建立起始培养（见方案 13.3 )，按 5x104~1x105 个/ml 的密度接种细胞。将培养物放在磁力搅拌器上，以 60 rpm 搅拌，直至培养细胞密度达到 5x105~1x106 个/ml（注意：因细胞可发生凋亡，细胞密度不要超过 1x106 个/ml）。
2. 如图安装大搅拌瓶。
3. 向瓶内加入 4 L 培养液。
4. 用可处理的滴管或注射器向瓶内加入 0.4 ml 抗泡沫剂。
5. 用 CO2 通气盖关闭侧臂孔。
6. 将瓶放在磁力搅拌器上，置于 37℃暖房或培养箱中。
7. 通过无菌的微孔内流式滤膜，将 5% CO2 通气管连到气体入口的 Luer 管上。
8. 以 10~15 ml/min 的流速开放气体。
9. 以 60 rpm 搅拌培养液。 .
10. 将大搅拌瓶孵育 2 h ，使温度和 CO2 张力达到平衡。
11. 关闭 CO2，将瓶与 CO2 管断开。
12. 将大搅拌瓶和起始培养细胞一起带回层流通风橱。
13. 将起始细胞缓慢地一次倒入大搅拌瓶中。
14. 将大搅拌瓶放回 37℃ 培养箱或暖房中。
15. 以 60 rpm 重新开始搅拌。
16. 再连通 5% CO2 通气管，将气流调整至 10~15 ml/min（如果通气管上没有流量表，可通过计数气泡估计流速）。
17. 将细胞培养 4~7 天，每天取样检査细胞增长率。
(a)将搅拌瓶带回层流通风橱。
(b)移去侧臂盖。
(c)吸取 5~10 ml 细胞悬液。
(d)计数细胞，通过染色排斥实验检査细胞的存活能力。
18. 当细胞浓度达到所需水平
(a)关闭通气管和磁力搅拌器。
(b)中断搅拌瓶的气体供应。
(c)把搅拌瓶带到实验室，将细胞注入离心培养瓶。
(d)离心（100 g，10 min )，按照用途收集细胞（从小滴）或上淸液。
来源：丁香实验
