原理
从妊娠 17 d 或 18 d 的胎鼠取出脑（与地方动物伦理委员会联系），将脑制成单细胞悬液。通过在用琼脂预涂的多孔培养板中培养，使脑细胞形成聚集物。在 20 d 的培养过程中，聚集物中的细胞形成成熟的器官样脑结构。
材料与仪器
PBSA Ⅱ型胰蛋白酶
Dulbecco改良的Eagle’s培养液
琼脂 多孔组织培养板 Petri培养皿 试管 手术刀 解剖剪 外科镊 锥形瓶 水浴箱
Dulbecco改良的Eagle’s培养液
琼脂 多孔组织培养板 Petri培养皿 试管 手术刀 解剖剪 外科镊 锥形瓶 水浴箱
步骤
按照以下步骤用琼脂培养液涂多孔培养板的孔：
(a)在锥形瓶中制备 3% 琼脂储存溶液（每100 ml D-PBSA 中加入 3 g 琼脂）；
(b)在沸水中将烧瓶加热直至琼脂溶解。在沸水中放一个空锥形瓶，将 10 ml 热琼脂溶液注入此烧瓶中；
(c)向烧瓶内慢慢加入预温的完全生长培养液，直至培养液在琼脂内的浓度达到 0.75%；
(d)在多孔培养板的每个孔内加入 0.5 ml 温培养液-琼脂溶液；
(e)使琼脂冷却和胶化。
这些多孔培养板可在冷藏箱内储存一周。
1. 在无菌条件下，从妊娠 17 d 或 18 d 胎鼠的同窝仔切出整个脑，然后将脑组织放入含 D-PBSA 的 10 cm Petri 培养皿中。
2. 用手术刀将组织切成约 0.5 cm3 小块。
3. 将组织块移入一个试管，用 D-PBSA 洗 3 次。每次清洗之间让组织沉降至管底。
4. 向组织内加入 5 ml 胰蛋白酶溶液，在 37℃水浴箱中消化 5 min。
5. 用 Pasteur 吸管吹打约 20 次，将组织分散。
6. 让组织沉降 3 min，然后将无组织块的混着细胞悬液移入含 5 ml 生长培养液的试管内。
7. 向未分散的组织加入 5 ml 新鲜的胰蛋白酶溶液，重复消化和分散步骤 2 次以上。
8. 将细胞悬液离心（200 g ，5 min )。
9. 吸去上清液，用 10 ml 生长培养液混悬和收集细胞。
10. 计数细胞，在每个涂琼脂的孔内加入 1 ml 细胞悬液（3x106 个细胞）。
11. 将多孔培养板放入 CO2 培养箱，培养 48 h 。
12. 将细胞聚集物移入无菌的 10 cm Petri培养皿中，并加入 10 ml 生长培养液。
13. 用 Pasteur 吸管将大的聚集物分别移到新的涂有琼脂的多孔板。
14. 每 3 d 更换培养液 1 次。小心地吸去原有培养液，添加新鲜培养液，覆盖聚集物。
在 20 d 培养过程中，细胞聚集物可变为球形，发育形成器官样结构。
(a)在锥形瓶中制备 3% 琼脂储存溶液（每100 ml D-PBSA 中加入 3 g 琼脂）；
(b)在沸水中将烧瓶加热直至琼脂溶解。在沸水中放一个空锥形瓶，将 10 ml 热琼脂溶液注入此烧瓶中；
(c)向烧瓶内慢慢加入预温的完全生长培养液，直至培养液在琼脂内的浓度达到 0.75%；
(d)在多孔培养板的每个孔内加入 0.5 ml 温培养液-琼脂溶液；
(e)使琼脂冷却和胶化。
这些多孔培养板可在冷藏箱内储存一周。
1. 在无菌条件下，从妊娠 17 d 或 18 d 胎鼠的同窝仔切出整个脑，然后将脑组织放入含 D-PBSA 的 10 cm Petri 培养皿中。
2. 用手术刀将组织切成约 0.5 cm3 小块。
3. 将组织块移入一个试管，用 D-PBSA 洗 3 次。每次清洗之间让组织沉降至管底。
4. 向组织内加入 5 ml 胰蛋白酶溶液，在 37℃水浴箱中消化 5 min。
5. 用 Pasteur 吸管吹打约 20 次，将组织分散。
6. 让组织沉降 3 min，然后将无组织块的混着细胞悬液移入含 5 ml 生长培养液的试管内。
7. 向未分散的组织加入 5 ml 新鲜的胰蛋白酶溶液，重复消化和分散步骤 2 次以上。
8. 将细胞悬液离心（200 g ，5 min )。
9. 吸去上清液，用 10 ml 生长培养液混悬和收集细胞。
10. 计数细胞，在每个涂琼脂的孔内加入 1 ml 细胞悬液（3x106 个细胞）。
11. 将多孔培养板放入 CO2 培养箱，培养 48 h 。
12. 将细胞聚集物移入无菌的 10 cm Petri培养皿中，并加入 10 ml 生长培养液。
13. 用 Pasteur 吸管将大的聚集物分别移到新的涂有琼脂的多孔板。
14. 每 3 d 更换培养液 1 次。小心地吸去原有培养液，添加新鲜培养液，覆盖聚集物。
在 20 d 培养过程中，细胞聚集物可变为球形，发育形成器官样结构。
来源：丁香实验
