原理
用琼脂或甲基纤维素混悬骨髓细胞，然后将细胞接种于培养皿，加入合适的生长因子。
材料与仪器
骨髓细胞 甲基纤维素 Noble琼脂 FBS 生长因子 10%BSA Wehi-CM
Alpha培养基 Petri培养皿 水浴箱 培养箱
Alpha培养基 Petri培养皿 水浴箱 培养箱
步骤
甲基纤维素液的配制：
(a)称 7.2 g 甲基纤维素，放入盛有 1 个较大磁棒的 500 ml 瓶；
(b)将甲基纤维素高压灭菌；
(c)加入 400 ml 加热至 90℃的无菌超纯水，将甲基纤维素弄湿；
(d)在 4℃ 条件下，搅拌过夜，使甲基纤维素溶解，得到 2x 甲基纤维素。用不带针头的注射器分装甲基纤维素比吸管更精确。
Alpha 培养液的储存液配制：
(a)粉末状 Alpha 培养基（GIBCO，10 L 包装量）；
(b)100 ml 100xMEM 维生素储存液；
(c)200 mg 硫酸庆大霉素。
在加热的搅拌器上搅拌培养液，直至培养基溶解。温度不要超过37℃ 。然后，加入超纯水，制成3 L 。在用孔径为 0.22 um 的滤器进行最终过滤之前，最好先后用孔径为 5 um 、1.2 um、0.8 um 和 0.45 um 的滤器过滤。分装成 21 ml，在 -20℃ 条件下储藏。
2xAlpha 培养液的配制：
(a)21 ml Alpha 培养液的储存液；
(b)25 ml 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）；
(c)1 ml 谷氨酰胺（200 mmol/L）；
(d)3 ml 7.5% 碳酸氢钠。
将上述成分放入无菌瓶，混合，平衡至 37℃。
一、BFU-E、CFC-mix 和 CFU-GEMM 的培养
1. 将添加 BSA 的 2xAlpha 培养液和等量的 2x甲基纤维素混合，制成实验需要的培养液。将混合液保持在冷的状态。当处于冷状态时，甲基纤维索较稀薄。
2. 准备细胞一式三份，但需准备用于 4 个培养皿那么多的混合培养液。由于甲基纤维素粘于试管壁上，常会丢失一些。
3. 将需要浓度的生长因子加入试管内。
4. 加入 5x104 个细胞。
5. 加入 1x培养液，使总量至 4.4 ml。将试管放在旋涡混合器上，混合。
6. 用注射器将 1 ml 细胞悬液注入 3 cm 非培养级培养皿。
7. 在 37℃ 以及 10% CO2 和 5% O2 的湿润气体条件下，将细胞培养 8~15 d。
克隆鉴定
BFU-E 集落可以是由很小的细胞构成的单一集落，也可以是多中心集落（像炸弹爆炸），每个集落有紧密排列的很小的淡红色细胞或红色细胞。这些集落的发生率为 40~80 个/105 个骨髓细胞。
CFC-mix 集落是单一而密集的集落，通常有细胞光环，细胞体积差别较大。集落可以是多中心的，但细胞显然是多源性的。CFC-mix 集落发生率为 100~180 个/105 个骨髓细胞，其中约 10 % 集落为含有红细胞系细胞的混合性集落。如果红细胞系细胞不是红色，对于无经验者来说很难准确鉴定这些集落。应当对集落进行摄影后取出细胞，然后离心，以便固定细胞和用 10% Giemsa 染色。通过鉴定细胞，帮助确认集落。
二、GM-CFC 的培养
1. 使用 30 mm Petri 培养皿（非培养级）。准备培养皿，并进行标记。
2. 配制 0.3 % 琼脂培养液，在 37℃ 条件下放置。
3. 准备骨髓细胞。用美蓝染色后计数有核细胞，或者用 Zapo-globin （Beckman Coulter）溶解细胞后再用电子细胞计数仪计数细胞核。
从每块股骨获得 1.0x107~1.5x107 个细胞。
4. 向每个培养皿加入 0.1 ng/ml rMurGM-CSF。
5. 加入 1 ml 含有 7.5x104 个细胞的琼脂培养液。然后，轻轻摇足，使细胞和琼脂混合。在室温条件下，让琼脂下沉。
6. 另外，可用 0.8 % 甲基纤维素培养液。用甲基纤维素培养液培养时，一般产生较紧密的集落。这种集落易于计数。
7. 将培养皿放入 1 个清洁的塑料盒内。
8. 将塑料盒放入湿润的培养箱内，在 37℃ 和 5 % O2 的条件下培养 6 d。
9. 用倒置显微镜计数含有 50 个细胞的集落，以 105 个种植细胞中的集落数表示。
10. 正常骨髓 GM-CFC 的发生率为 100~120 个/105 个骨髄细胞。
(a)称 7.2 g 甲基纤维素，放入盛有 1 个较大磁棒的 500 ml 瓶；
(b)将甲基纤维素高压灭菌；
(c)加入 400 ml 加热至 90℃的无菌超纯水，将甲基纤维素弄湿；
(d)在 4℃ 条件下，搅拌过夜，使甲基纤维素溶解，得到 2x 甲基纤维素。用不带针头的注射器分装甲基纤维素比吸管更精确。
Alpha 培养液的储存液配制：
(a)粉末状 Alpha 培养基（GIBCO，10 L 包装量）；
(b)100 ml 100xMEM 维生素储存液；
(c)200 mg 硫酸庆大霉素。
在加热的搅拌器上搅拌培养液，直至培养基溶解。温度不要超过37℃ 。然后，加入超纯水，制成3 L 。在用孔径为 0.22 um 的滤器进行最终过滤之前，最好先后用孔径为 5 um 、1.2 um、0.8 um 和 0.45 um 的滤器过滤。分装成 21 ml，在 -20℃ 条件下储藏。
2xAlpha 培养液的配制：
(a)21 ml Alpha 培养液的储存液；
(b)25 ml 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）；
(c)1 ml 谷氨酰胺（200 mmol/L）；
(d)3 ml 7.5% 碳酸氢钠。
将上述成分放入无菌瓶，混合，平衡至 37℃。
一、BFU-E、CFC-mix 和 CFU-GEMM 的培养
1. 将添加 BSA 的 2xAlpha 培养液和等量的 2x甲基纤维素混合，制成实验需要的培养液。将混合液保持在冷的状态。当处于冷状态时，甲基纤维索较稀薄。
2. 准备细胞一式三份，但需准备用于 4 个培养皿那么多的混合培养液。由于甲基纤维素粘于试管壁上，常会丢失一些。
3. 将需要浓度的生长因子加入试管内。
4. 加入 5x104 个细胞。
5. 加入 1x培养液，使总量至 4.4 ml。将试管放在旋涡混合器上，混合。
6. 用注射器将 1 ml 细胞悬液注入 3 cm 非培养级培养皿。
7. 在 37℃ 以及 10% CO2 和 5% O2 的湿润气体条件下，将细胞培养 8~15 d。
克隆鉴定
BFU-E 集落可以是由很小的细胞构成的单一集落，也可以是多中心集落（像炸弹爆炸），每个集落有紧密排列的很小的淡红色细胞或红色细胞。这些集落的发生率为 40~80 个/105 个骨髓细胞。
CFC-mix 集落是单一而密集的集落，通常有细胞光环，细胞体积差别较大。集落可以是多中心的，但细胞显然是多源性的。CFC-mix 集落发生率为 100~180 个/105 个骨髓细胞，其中约 10 % 集落为含有红细胞系细胞的混合性集落。如果红细胞系细胞不是红色，对于无经验者来说很难准确鉴定这些集落。应当对集落进行摄影后取出细胞，然后离心，以便固定细胞和用 10% Giemsa 染色。通过鉴定细胞，帮助确认集落。
二、GM-CFC 的培养
1. 使用 30 mm Petri 培养皿（非培养级）。准备培养皿，并进行标记。
2. 配制 0.3 % 琼脂培养液，在 37℃ 条件下放置。
3. 准备骨髓细胞。用美蓝染色后计数有核细胞，或者用 Zapo-globin （Beckman Coulter）溶解细胞后再用电子细胞计数仪计数细胞核。
从每块股骨获得 1.0x107~1.5x107 个细胞。
4. 向每个培养皿加入 0.1 ng/ml rMurGM-CSF。
5. 加入 1 ml 含有 7.5x104 个细胞的琼脂培养液。然后，轻轻摇足，使细胞和琼脂混合。在室温条件下，让琼脂下沉。
6. 另外，可用 0.8 % 甲基纤维素培养液。用甲基纤维素培养液培养时，一般产生较紧密的集落。这种集落易于计数。
7. 将培养皿放入 1 个清洁的塑料盒内。
8. 将塑料盒放入湿润的培养箱内，在 37℃ 和 5 % O2 的条件下培养 6 d。
9. 用倒置显微镜计数含有 50 个细胞的集落，以 105 个种植细胞中的集落数表示。
10. 正常骨髓 GM-CFC 的发生率为 100~120 个/105 个骨髄细胞。
来源：丁香实验
