方案20.1 冷冻细胞
最新修订时间：
原理
细胞生长至对数晚期，以培养基制备高浓度细胞悬液，加入细胞保护剂，等份转移至冻存管中，缓慢冷冻（图 20.8）。
<center> <div> <img src="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/13/51693495.png" /></div> </center>
<center> <p> 细胞用胰酶消化后，加入含有细胞保护剂的培养基，分装至冻存管中，然后将其夹到铝条上，用纸质管包裹，放入隔热储存管中。将储存管及其内容物于-70℃或-80℃存放4h或过夜，最后将含有冻存管的纸质管置入液氮罐的储存管中。</p> </center>
<center> <div> <img src="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/13/51693495.png" /></div> </center>
<center> <p> 细胞用胰酶消化后，加入含有细胞保护剂的培养基，分装至冻存管中，然后将其夹到铝条上，用纸质管包裹，放入隔热储存管中。将储存管及其内容物于-70℃或-80℃存放4h或过夜，最后将含有冻存管的纸质管置入液氮罐的储存管中。</p> </center>
材料与仪器
步骤
材料
无菌
准备冻存的细胞（如果是贴壁细胞：配制无菌PBSA和0.25%的粗胰蛋白酶）
生长培养基（血清能促进冷冻后细胞的存活；血清浓度可达50%，或用纯血清。如血清使用于不需要血清的细胞时，在复苏后应清洗掉。）
细胞保护剂，无杂志（见前）：二甲基亚砜保存于玻璃瓶中或聚丙烯管中，或新鲜准备的甘油，治愈普通容器中
注射器：1~5ml，用于分装甘油（有毒）
塑料小管，预先标记上细胞系的名称以及冻存日期
非灭菌
血细胞计数板或电子细胞计数器
储存管或支架（支架可能已经在冻存器中了）
冻存用的隔热容器：聚苯乙烯盒衬以脱脂棉，或泡沫塑料隔热管（图20.2； 或使用可控制冷冻速率的冷冻箱，图20.5）
手套，腈制的
<center> <a href="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/33/60861503.jpg" target="_blank"><img src="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/33/60861503.snap.jpg" /></a></center><center> <a href="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/33/86624059.jpg" target="_blank"><img src="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/33/86624059.snap.jpg" /></a></center>操作步骤
1. 确保细胞满足冷冻标准， 肉眼及显微镜观察；
（a） 外观健康
（b）形态学特征
（c）生长周期（应处于平台期前的对数生长晚期）
（d）无污染
2. 使细胞生长至对数生长晚期，若为贴壁细胞，用胰酶消化，并进行细胞技术（见方案13.2）。若为悬浮生长细胞，进行细胞计数并离心。
3. 悬浮细胞的浓度为：2x106 个~2x107 个细胞/ml.
4. 将以下任意一种细胞保护剂加入到生长培养基中，配制冻存液：
（a） 加10%~20%的二甲基亚砜（DMSO）或（b）加20%~30%甘油。
安全提示
二甲基亚砜能穿透许多合成的或天然的膜，包括皮肤和橡胶手套[Horita and Weber, 1964] 。因此，任何常用的具有潜在危险的物质（如致癌剂）均可能穿透皮肤，甚至能透过橡胶手套而进入血液循环。存在任何毒性的情况下，均应谨慎处理。
5. 用冻存液将细胞悬液按1：1的比例稀释至细胞度浓约为1x106 ~1x107 /ml ,此时DMSO的浓度为5%-10%（或甘油浓度为10-15%）。建议勿将冻存管置于冰上，减少细胞退化。使用DMSO时，室温操作30min是无害的，当使用甘油时，则对细胞是有益的。
6. 将细胞悬液分装至预先标记好的冻存管中，盖上盖子，拧紧，密封，注意不要太紧，避免螺旋扭曲变形。
7. 将冻存管夹在铝条上，装入储存筒中（图20.2），或将其松散地排列在抽屉储存器中。
8. 将冻存管通过上述方法之一以1℃/min的速率进行冷冻。使用隔热保温的方法，使冻存管达到-70℃，若最初温度为20℃，则需4~6h，但最好于-70℃过夜。
9.当冻存管温度达到-70℃或更低时，在将其从-70℃或能控制冷冻速率的冷冻柜中转移出来之前，检查冷冻记录，确定液氮罐中存放冻存管的合适位置。
10. 将冻存管转移至液氮冷冻罐中，最好不要使其浸没在液氮中，将放油冻存管的铝条和纸质管放入预先确定的储存筒中，或将个别冻存管放入预先确定的抽屉中。该步 骤必须迅速（＜2min），因为冻存管会以越10℃/min的速度升温，如果温度上升超过-50℃，细胞会迅速恶化。
安全提示
将冻存管放入液氮时，必须使用保护性手套和面罩。
11.冻存管安全地置于冷冻罐后，必须在冷冻目录中进行记录（表20.2和表20.3）
无菌
准备冻存的细胞（如果是贴壁细胞：配制无菌PBSA和0.25%的粗胰蛋白酶）
生长培养基（血清能促进冷冻后细胞的存活；血清浓度可达50%，或用纯血清。如血清使用于不需要血清的细胞时，在复苏后应清洗掉。）
细胞保护剂，无杂志（见前）：二甲基亚砜保存于玻璃瓶中或聚丙烯管中，或新鲜准备的甘油，治愈普通容器中
注射器：1~5ml，用于分装甘油（有毒）
塑料小管，预先标记上细胞系的名称以及冻存日期
非灭菌
血细胞计数板或电子细胞计数器
储存管或支架（支架可能已经在冻存器中了）
冻存用的隔热容器：聚苯乙烯盒衬以脱脂棉，或泡沫塑料隔热管（图20.2； 或使用可控制冷冻速率的冷冻箱，图20.5）
手套，腈制的
<center> <a href="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/33/60861503.jpg" target="_blank"><img src="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/33/60861503.snap.jpg" /></a></center><center> <a href="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/33/86624059.jpg" target="_blank"><img src="http://img.dxycdn.com/upload/2015/06/22/33/86624059.snap.jpg" /></a></center>操作步骤
1. 确保细胞满足冷冻标准， 肉眼及显微镜观察；
（a） 外观健康
（b）形态学特征
（c）生长周期（应处于平台期前的对数生长晚期）
（d）无污染
2. 使细胞生长至对数生长晚期，若为贴壁细胞，用胰酶消化，并进行细胞技术（见方案13.2）。若为悬浮生长细胞，进行细胞计数并离心。
3. 悬浮细胞的浓度为：2x106 个~2x107 个细胞/ml.
4. 将以下任意一种细胞保护剂加入到生长培养基中，配制冻存液：
（a） 加10%~20%的二甲基亚砜（DMSO）或（b）加20%~30%甘油。
安全提示
二甲基亚砜能穿透许多合成的或天然的膜，包括皮肤和橡胶手套[Horita and Weber, 1964] 。因此，任何常用的具有潜在危险的物质（如致癌剂）均可能穿透皮肤，甚至能透过橡胶手套而进入血液循环。存在任何毒性的情况下，均应谨慎处理。
5. 用冻存液将细胞悬液按1：1的比例稀释至细胞度浓约为1x106 ~1x107 /ml ,此时DMSO的浓度为5%-10%（或甘油浓度为10-15%）。建议勿将冻存管置于冰上，减少细胞退化。使用DMSO时，室温操作30min是无害的，当使用甘油时，则对细胞是有益的。
6. 将细胞悬液分装至预先标记好的冻存管中，盖上盖子，拧紧，密封，注意不要太紧，避免螺旋扭曲变形。
7. 将冻存管夹在铝条上，装入储存筒中（图20.2），或将其松散地排列在抽屉储存器中。
8. 将冻存管通过上述方法之一以1℃/min的速率进行冷冻。使用隔热保温的方法，使冻存管达到-70℃，若最初温度为20℃，则需4~6h，但最好于-70℃过夜。
9.当冻存管温度达到-70℃或更低时，在将其从-70℃或能控制冷冻速率的冷冻柜中转移出来之前，检查冷冻记录，确定液氮罐中存放冻存管的合适位置。
10. 将冻存管转移至液氮冷冻罐中，最好不要使其浸没在液氮中，将放油冻存管的铝条和纸质管放入预先确定的储存筒中，或将个别冻存管放入预先确定的抽屉中。该步 骤必须迅速（＜2min），因为冻存管会以越10℃/min的速度升温，如果温度上升超过-50℃，细胞会迅速恶化。
安全提示
将冻存管放入液氮时，必须使用保护性手套和面罩。
11.冻存管安全地置于冷冻罐后，必须在冷冻目录中进行记录（表20.2和表20.3）
常见问题
来源动物细胞培养：基础技术指南第五版
来源：丁香实验
