方案 21.8 多孔培养板中单层培养细胞生长曲线的绘制实验

以三种不同的细胞浓度在多孔板中培养三组细胞，在达到平台期之前，每天计数一个板中的细胞。

材料

无菌

单层细胞培养：A549、Vero 或 HeLa-S3, 75 cm² 培养瓶，晚对数期 1 瓶

0.25% 粗制胰蛋白酶混合有 10 mmol/L EDTA 5 ml

生长液，100 ml, 伴有 26 mmol/L NaHCO₃ 300 ml

D-PBSA(预洗并用于细胞计数）50 ml

12 孔培养板 10 块

非无菌：

用于装培养板的塑料盒
CO₂ 温箱或 5% CO₂ 以充盈塑料盒

操作步骤

1. 对于一般的传代，先用胰蛋白酶消化细胞（见方案 13.2)。

2. 稀释细胞悬液分别至 1X10⁵ 个/ml，3X10⁴ 个/ml 和 1X10⁴ 个/m l，每种浓度均含 25 ml 培养基。

3. 用 3 块 12 孔板，每孔一种细胞浓度，每孔 2 ml 细胞悬液。最上面四孔加 1X10⁴ 个/ml，第二排加 3X10⁴ 个/ml，第三排加 1X10⁵ 个/ml (图 21. 7)。从孔的中央处慢慢地将细胞悬液加入，这样不会使液体在孔内产生旋涡。同样地不要摇动培养板以期混合细胞，因为培养基的圆周运动会使细胞集中在孔的中央。

4. 将培养板贾于湿润的 CO₂ 湿箱内，或者用 5%C0₂ 充盈塑料盒，然后封闭。

5. 24 h 后，将培养板从温箱中取出第一块板，计数每种浓度的 3 个孔中的细胞数：

(a) 将含有要计数细胞的 3 个孔中的培养液完全吸掉；
(b ) 加入 0.5 ml 胰蛋内酶/EDTA 至上述 3 个孔中；
(c) 温育培养板 15 min；
(d ) 加人 0.5 ml 含血清的培养基，在胰蛋白酶/EDTA/培养基中将细胞分离开来，取 0.4 ml 细胞悬液至 19.6 ml 的 D-PBSA 中；
(e) 用电子细胞计数器计数细胞。

6. 染剩余不同密度孔中的细胞（见 16. 4.2 节）。

提示 也可以用血球计数板进行细胞计数，但这对于细胞浓度较低者比较困难。如果要用血球计教板，可将胰蛋白酶的容积减少至 0.1 ml，小心地用微吸管将细胞分散，使之不产生气泡，然后将细胞移至血球计数板。

7. 如第 5 、6 步，在 48 和 72 h 时重复取样。

8. 于 72 h 时或者更早一些时间换培养液，这可依据 pH 的下降来决定（见方案 13.1，彩图 22b )。

9. 对于迅速生长的细胞（即 PDT 为 12～24 h 的细胞）可以每天连续取样，但是对于生长缓慢的细胞（也就是 PDT > 24 h )，则每两天取样，直至细胞达到平台期。

10. 依据 pH 的改变，每 1、2 或 3 天换培养基。