原理
基因是由平均1000～3000核苷酸组成的序列，在光学显微镜下是难以识别的。为显示染色体上特定基因必须具备以下三个重要条件：
1. 需要具有能与目的基因相特异接合（互补）的核苷酸序列即探针（Probe）；
2. 需要有能与探针相结合的标记物（常用同位素和荧光素）；
3. 制备出良好的染色体标本。
在进行定位时，首先要使标记物与探针相接合（Lable：标记），形成探针/标记物复合物，然后再使复合物与染色体DNA 进行杂交（Hybridization）。所谓杂交，即两条来源不同的单链DNA能互补形成双链DNA的过程。在一般情况下，染色体上被定位的目的基因和探针都是双链状态的DNA，两者杂交只有在解链状态下，即都变成单链时才能发生。温度是使双链DNA解链的条件，在80 ℃温度下DNA即发生解链（变性）。因此当把染色体与探针置于同温条件下，两者便同时解链成为单链DNA；当温度下降时，两者DNA又重新恢复双链状态（复性）；在复性中探针的单链即可与目的基因单链发生杂交。由于探针DNA 携有标记物，用相应的方法能使标记物显现成为可见形态。在用同位素作标记物时，可用放射自显影法显现探针/同位素；用荧光素作标记物时，探针/荧光素能在荧光显微镜下发光，从而可观察到和确定探针的位点（也即目的基因存在位点）。标记探针与染色体基因（或细胞质mRNA）杂交定位法称原位杂交（In Situ Hybridization）。
1. 需要具有能与目的基因相特异接合（互补）的核苷酸序列即探针（Probe）；
2. 需要有能与探针相结合的标记物（常用同位素和荧光素）；
3. 制备出良好的染色体标本。
在进行定位时，首先要使标记物与探针相接合（Lable：标记），形成探针/标记物复合物，然后再使复合物与染色体DNA 进行杂交（Hybridization）。所谓杂交，即两条来源不同的单链DNA能互补形成双链DNA的过程。在一般情况下，染色体上被定位的目的基因和探针都是双链状态的DNA，两者杂交只有在解链状态下，即都变成单链时才能发生。温度是使双链DNA解链的条件，在80 ℃温度下DNA即发生解链（变性）。因此当把染色体与探针置于同温条件下，两者便同时解链成为单链DNA；当温度下降时，两者DNA又重新恢复双链状态（复性）；在复性中探针的单链即可与目的基因单链发生杂交。由于探针DNA 携有标记物，用相应的方法能使标记物显现成为可见形态。在用同位素作标记物时，可用放射自显影法显现探针/同位素；用荧光素作标记物时，探针/荧光素能在荧光显微镜下发光，从而可观察到和确定探针的位点（也即目的基因存在位点）。标记探针与染色体基因（或细胞质mRNA）杂交定位法称原位杂交（In Situ Hybridization）。
材料与仪器
染色体标本
放射性核素
放射性核素
步骤
一、放射性核素探针掺入程序
1. 探针制备
2. 缺口翻译
（1）同位素减压浓缩
取3H-dTTP（1 μC/ml）50 μl～100 μl，置入Eppendorf管中真空中减压抽干；
（2）缺口翻译反应
另取探针DNA1 μg加入Eppendorf管中，再加入10×缺口翻译缓冲液5 μl；
缺口翻译缓冲液组成为
MgSO4 0.1 M
二硫苏糖醇 1 mM
牛血清白蛋白 500 μg/ml
（3）再加入dATP、dGTP、dCTP 各1 mM；用蒸馏水稀释至50 μl；
（4）混合
移入已真空干燥含有3H-dTTP的Eppendorf管中，混匀；
（5）加酶
加入DNA 聚合酶I、DNA多聚酶I各1 ml，封口；
（6）反应
16 ℃中反应10 分钟，加0.5 M EDTA终上反应；
（7）探针分离
将上述反应液加入Sephadex G50层析柱中，用TE洗脱分离。
二、探针与染色体分子原位杂交
1. 杂交液配制
甲酰胺 50.0 %
硫酸葡萄糖 10.0 %
EDTA 5.0 mM
聚乙烯吡咯烷酮 0.04 %
聚蔗糖 0.04 %
牛血清白蛋白 0.04 %
氯化钠 300 mM
柠檬酸钠 300 mM
磷酸盐缓冲液 20 mM
小牛胸腺DNA 50 μg/ml
以上成分相混合，pH7.0±0.1。
3. 染色体DNA 变性
（2）脱水
过70％、80％，90％、100％酒精脱水；
（3）变性
置染色体标本入2×SSC 甲酰胺溶液中，70 ℃处理2 分钟（不能过长）；
（4）迅速投入30％冷乙醇溶液中；
（5）脱水
同(2)；
（6）干燥
自然干燥。
4. 探针与染色体杂交
（1）每一染色体标本上加杂交液50 μl，覆一盖片；42 ℃于潮湿皿中杂交16 小时；
（2）洗脱
30～40 ℃下，50％甲酰胺溶液中洗5 次、2×SSC 溶液中洗5 次，0.1×SSC溶液洗3 次（洗脱过分影响杂交率）；
（3）脱水
与前相同；
（4）干燥
自然干燥。
5. 放射自显影
（2）曝光
4 ℃冰箱中曝光10 天后（比活性107 cpm/μg 以上），取出；
（3）显影
用D19B 显影液，显影2～5 分钟；
（4）定影
柯达F-5 定影液定影10 分钟；
（5）水洗
15 分钟。
6. 染色体显带
（2）染色
迅速漫入10％Giemsa染色液中染2～3 分钟；
（3）水洗、干燥、镜下观察。
1. 探针制备
2. 缺口翻译
（1）同位素减压浓缩
取3H-dTTP（1 μC/ml）50 μl～100 μl，置入Eppendorf管中真空中减压抽干；
（2）缺口翻译反应
另取探针DNA1 μg加入Eppendorf管中，再加入10×缺口翻译缓冲液5 μl；
缺口翻译缓冲液组成为
Tris-Cl 缓冲液 0.5 M
MgSO4 0.1 M
二硫苏糖醇 1 mM
牛血清白蛋白 500 μg/ml
（3）再加入dATP、dGTP、dCTP 各1 mM；用蒸馏水稀释至50 μl；
（4）混合
移入已真空干燥含有3H-dTTP的Eppendorf管中，混匀；
（5）加酶
加入DNA 聚合酶I、DNA多聚酶I各1 ml，封口；
（6）反应
16 ℃中反应10 分钟，加0.5 M EDTA终上反应；
（7）探针分离
将上述反应液加入Sephadex G50层析柱中，用TE洗脱分离。
二、探针与染色体分子原位杂交
1. 杂交液配制
3H 标记探针 1.0 μg/ml
甲酰胺 50.0 %
硫酸葡萄糖 10.0 %
EDTA 5.0 mM
聚乙烯吡咯烷酮 0.04 %
聚蔗糖 0.04 %
牛血清白蛋白 0.04 %
氯化钠 300 mM
柠檬酸钠 300 mM
磷酸盐缓冲液 20 mM
小牛胸腺DNA 50 μg/ml
以上成分相混合，pH7.0±0.1。
2. 探针变性
将杂交液混合，置于70 ℃水浴中，作用5 分钟后，再把含有杂交液的小管插入碎冰中。
将杂交液混合，置于70 ℃水浴中，作用5 分钟后，再把含有杂交液的小管插入碎冰中。
3. 染色体DNA 变性
（1）在每张染色体标本上，加100 μg/ml RNA酶50 μl（为去除RNA），置一盖玻片，置于潮湿皿中，37 ℃孵育1 小时；去除盖片，浸入2×SSC 缸中漂洗4 次；
（2）脱水
过70％、80％，90％、100％酒精脱水；
（3）变性
置染色体标本入2×SSC 甲酰胺溶液中，70 ℃处理2 分钟（不能过长）；
（4）迅速投入30％冷乙醇溶液中；
（5）脱水
同(2)；
（6）干燥
自然干燥。
4. 探针与染色体杂交
（1）每一染色体标本上加杂交液50 μl，覆一盖片；42 ℃于潮湿皿中杂交16 小时；
（2）洗脱
30～40 ℃下，50％甲酰胺溶液中洗5 次、2×SSC 溶液中洗5 次，0.1×SSC溶液洗3 次（洗脱过分影响杂交率）；
（3）脱水
与前相同；
（4）干燥
自然干燥。
5. 放射自显影
（1）涂片
用国产核子乳胶（1：1）稀释液涂片；
用国产核子乳胶（1：1）稀释液涂片；
（2）曝光
4 ℃冰箱中曝光10 天后（比活性107 cpm/μg 以上），取出；
（3）显影
用D19B 显影液，显影2～5 分钟；
（4）定影
柯达F-5 定影液定影10 分钟；
（5）水洗
15 分钟。
6. 染色体显带
（1）置已曝光片子浸入下液中
Na2SO4 50.0 mM
Na2B4O7 2.5 mM
37 ℃，预处理10～30 秒；
（2）染色
迅速漫入10％Giemsa染色液中染2～3 分钟；
（3）水洗、干燥、镜下观察。
常见问题
一、结果
二、讨论
染色体DNA变性充分，利于与探针杂交，但变性过度不利显带。变性中加70％甲酰胺效果较好，能保证在较低温度下进行变性和维持染色体形态。杂交液中加10％的硫酸葡聚糖较好，有提高杂交率作用，但不能过高，否则本底亦高。探针浓度亦应适当，过低需延长曝光时间，本底随之增加；过高探针可自相结合影响杂交率。加入探针的量与DNA片段大小有关，经验数值是，10 kb片段DNA浓度应为0.5～0.05 mg/L。
成功情况下可见：染色体分带良好、除染色体外，在各处可见散在的、直径1～3 微米的黑色圆形颗粒，有的颗粒位于染色体上，有的位于染色体间。观察50～100 个分裂相，并统计颗粒存在于某号染色体上规律性位点、统计、在特定染色体的特定位点出现机率占8％～40％以上者，可视为该基因的位点。
二、讨论
染色体DNA变性充分，利于与探针杂交，但变性过度不利显带。变性中加70％甲酰胺效果较好，能保证在较低温度下进行变性和维持染色体形态。杂交液中加10％的硫酸葡聚糖较好，有提高杂交率作用，但不能过高，否则本底亦高。探针浓度亦应适当，过低需延长曝光时间，本底随之增加；过高探针可自相结合影响杂交率。加入探针的量与DNA片段大小有关，经验数值是，10 kb片段DNA浓度应为0.5～0.05 mg/L。
来源：丁香实验
