煮沸小量制备法
最新修订时间:
原理
推荐采用本方案从1~24个菌落培养液中制备少量的质粒DNA,尽管该方案十分快捷,但制备的DNA的质量要比碱裂解法差。
材料与仪器
培养基
STET TE
平板
STET TE
平板
步骤
1. 接种一个单菌落于5 ml LB培养基中,于37 °C培养至饱和状态或至少到对数生长中期(约6 h)。
2. 取1.5 ml菌液以最大转速离心20 s,弃上清。
3. 加入300 μl含200 μg溶菌酶的STET溶液重悬沉淀。在涡旋混合器上振荡混匀,冰上放置 30 s~10 min。
4. 将管放人沸水中(100°C) 1~2 min。
5. 离心15~30 min,吸上清移人一个新的微量离心管中。
6. 加人200 μl预冷的异丙醇,于-20°C放置15~30 min。
7. 以最大转速离心5 min,倒转离心管,弹数次,去除上清,真空干燥直至沉淀呈透明。
8. 沉淀溶于50 μl TE缓冲液中,于4°C短期保存,于-20°C或-70°C长期保存。取5 μl进行限制酶酶切分析。
2. 取1.5 ml菌液以最大转速离心20 s,弃上清。
3. 加入300 μl含200 μg溶菌酶的STET溶液重悬沉淀。在涡旋混合器上振荡混匀,冰上放置 30 s~10 min。
4. 将管放人沸水中(100°C) 1~2 min。
5. 离心15~30 min,吸上清移人一个新的微量离心管中。
6. 加人200 μl预冷的异丙醇,于-20°C放置15~30 min。
7. 以最大转速离心5 min,倒转离心管,弹数次,去除上清,真空干燥直至沉淀呈透明。
8. 沉淀溶于50 μl TE缓冲液中,于4°C短期保存,于-20°C或-70°C长期保存。取5 μl进行限制酶酶切分析。
注意事项
1. 为了获得高产量的DNA,一定要使菌体完全重悬。
2. 如有必要,往待消化混合液中加人1μl 10 mg/ml RNA酶溶液(不含DNA酶)以去除污染的RNA。
2. 如有必要,往待消化混合液中加人1μl 10 mg/ml RNA酶溶液(不含DNA酶)以去除污染的RNA。
常见问题
1. 参考文献:Birnboim,1983; Heetal,1991;Holmes and Quigley,1981。
2. 撰稿人:JoAnneEngebrecht,Roger Brent,and Mustak A,Kaderbhai。
来源:丁香实验