液氮冻存法
最新修订时间：
原理
目前长时间保存细胞的方法是将细胞低温冻结保存在液氮中（－196 ℃），保存时间可长达一年甚至几年，用时解冻，大多数细胞仍能生长繁殖，为妥善起见，细胞冻存一年后应复苏培养后再冻存。冻存细胞时应加入保护剂，否则，细胞内外的水会结成冰晶，使细胞发生机械损伤。加入保护剂后，可使冰点降低，在缓慢冻结的条件下，细胞内的水分在冻结前渗出到细胞外，避免冰晶的损伤。目前常用的保护剂为甘油和二甲基亚砜（DMSO），它们对细胞无毒，分子量小溶解度大，易穿透细胞，使用浓度甘油为10％～20％，二甲基亚砜5％～15％，常用为10％。另外，冻存液中还要加入培养液，以提供营养，渗透压，pH。细胞复苏指融化冻存的细胞，重新培养。解冻细胞速度要快，使之迅速通过最易损伤的－5～0 ℃。
材料与仪器
对数生长期细胞
消化液 培养液 甘油 DMSO酒精 水
吸管 离心管 冻存管 培养瓶 记号笔 纱布小口袋 温度计 砂轮
消化液 培养液 甘油 DMSO酒精 水
吸管 离心管 冻存管 培养瓶 记号笔 纱布小口袋 温度计 砂轮
步骤
一、细胞冻存
1. 细胞悬液制备
选对数生长期细胞，10 ml 培养瓶面，几乎成单层时可冻存一管；收集细胞24 小时前换液一次；按传代方法制成细胞悬液。
2. 收集细胞
将细胞悬液移入无菌离心管中，1000 rpm，离心5 分钟，去上清。
3. 冻存液
将培养液和甘油按9：1 的比例配成10％的冻存液，取1～1.5 ml 到离心管中，轻轻吹打使细胞悬混。
4. 装瓶
用吸管吸取细胞悬液1.5 ml，装入安瓶中，尽量不使液体碰到安瓶口。
5. 封口
将安瓶在火焰最热处封好，如用冻存管将盖儿拧紧即可。
6. 标记
用记号笔记好细胞名称，冻存年月日。
7. 冻结和保存
将安瓶装在纱布袋中，置4 ℃ 2～4 小时，－20 ℃ 2～4 小时，液氮的气相部分－130 ℃～－180 ℃，浸入液氮。液氮量一定要充分，以使温度恒定。
二、细胞复苏
1. 用大镊子取出液氮中的安瓶，投入盛有37～42 ℃的水中，不时摇动，使之快速通过－5～0 ℃。
2. 在超净台中，用砂轮擦安瓶颈并用酒精棉球消毒，打开安瓶，吸出细胞悬液装入培养瓶中，并以10×稀释，放CO2 培养箱中进行培养，第二天换新鲜培养液，以换掉冻存剂。
注意事项
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
常见问题
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
来源《中国医科大学实验指导手册》
来源：丁香实验
