指示剂法

最新修订时间：2024-05-13

原理

体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞，如HeLa 细胞、NIH3T3 等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞大多属于这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如HL₆₀ 细胞，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性细胞。在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验不可缺少的一种基本技能。

材料与仪器

HeLa细胞 NIH3T3 HL60 细胞
台盼兰染液胰蛋白酶 EDTA 混合消化液
倒置显微镜细胞计数板普通光学显微镜乳头吸管盖片

步骤

一、培养细胞形态观察

1. 将细胞培养瓶从37 ℃二氧化碳培养箱（或温箱）中取出，瓶口稍稍向上倾斜以免瓶内液体接触瓶塞或流出瓶口，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。

2. 打开倒置镜光源，用10X 物镜观察，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度，并调节双目镜的光瞳间距，使左右两个视场象合而为一。

3. 调节载物台高度进行对焦，在看到细胞层之后，用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，经常使用的是十倍的物镜。

4. 结果

贴壁细胞一般有两种形态，即上皮细胞型和成纤维细胞型细胞。上皮细胞型细胞呈扁平的不规则多角形，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如HeLa 细胞。成纤维细胞型细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2～3 个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，细胞生长时多呈放射状或漩涡状，如NIH₃T₃。

贴壁细胞在生长状态良好时，细胞均质而透明，细胞内颗粒少，看不到空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多，细胞轮廓增强反差较大时，表明细胞机能状态不良，生长较差。当培养瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。悬浮细胞边缘，透明发亮时，生长较好；反之，则较差或已死亡。由于培养基内有PH 指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时间过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、PH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态是基本一致的。在贴壁细胞的培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。

二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定

1. 准备计数板

用95％酒精棉球擦干净计数板，把盖片覆在计数板上面。

2. 制备细胞悬液

将培养瓶中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA 混合消化液1 ml，静置3~5 分钟，待见到细胞变圆，彼此不连接为止。将试管中的培养液倒回培养瓶中，并轻轻进行吹打，制成细胞悬液。

3. 染色

取细胞悬液0.5 ml，加入0.3％台盼兰染液0.5 ml，混合后染色3~5 分钟。

4. 滴加悬液

将悬液摇匀后，沿盖片边缘缓缓滴加少许已染色的细胞悬液于细胞计数板的斜面上，使液体自然充满整个计数室。小室内有气泡或液体过多使盖片漂移时，要重新滴加。

5. 计数

在普通光学显微镜10X 物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。

6. 结果

按下式进行细胞浓度的计算：

大格中细胞总数×10⁴①×稀释倍数＝细胞数/ml 悬液

大格中细胞总数－染色细胞数×10⁴②稀释倍数＝活细胞数/ml 悬液

注①由于四大格中每一大格体积为0.1 mm³，1 ml＝10，000 大格，因此，1大格细胞数×10⁴＝细胞数/ml。

注②染色标本在15 分钟内计数，因为台盼兰染液可使死细胞迅速染色，拖延计数时间活细胞也被着色。

进行细胞计数时应力求准确，因此，在科研中，往往将计数板两侧都加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板（或反复滴加一块计数板数次），最后取计数的平均值。

来源：丁香实验