示差光谱法

P-450 属于血红素蛋白，其还原型与CO结合后，在波长450 nm 处出现吸收峰。因此，可以应用示差光谱法测定其含量。肝匀浆样品中通以CO后，加还原剂连二亚硫酸钠（Na₂S₂O₄），然后在450 nm 和490 nm 处测定吸光度，其差值代入公式，即可计算出细胞色素P450的含量。

小鼠
生理盐水 苯巴比妥钠 放线菌素D 蔗糖溶液 Tris-HCl 缓冲液
分光光度计 扭力天平 制冰机 玻璃匀浆器 漏斗 试管 滤纸 移液管 冰盒

动物分为3 组：生理盐水组，苯巴比妥钠组及放线菌素D 组。
 
1.  苯巴比妥钠和放线菌素 D i.p.三天，诱导或抑制肝药酶。
 
2.  断头放血：于第三天（实验当日）将小鼠断头放血（须放净，因血红素会影响实验结果）；
 
3.  制备肝匀浆：将 0.25M 的蔗糖溶液和0.05M Tris-HCl 缓冲液置于冰块中预冷；剪下肝脏（肝组织不得少于400mg；勿破坏胆囊，因胆色素干扰实验结果；以滤纸吸去血迹，因血色素干扰实验结果）；扭力天平称重（垫锡纸；每次加样或加减法码时必须关上关平）；将肝组织置于匀浆器中，加入预冷后的0.25M 蔗糖（0.5ml/100mg 肝组织）；冰浴下研磨，直至组织变为淡粉色匀浆；取此匀浆液1ml，加入预冷后的0.05M Tris-HCl 缓冲液9ml，充分混匀；冰浴下充以CO，1～2 气泡/秒，通气2 分钟。
 
4.  通气完毕的溶液，倾入2 个比色杯中，一个作为参照杯，另一个作为样品杯。向样品杯中加入连二亚硫酸钠5mg，充分混匀。参照杯调零后，在450nm 和490nm 处测定样品杯的吸光度，按下式计算P-450 的含量：
 

 
5.  计算
 
（1）P-450 升高百分率：
 
[（Pheno – N.S.）/ N.S.] × 100%
 
（2）P-450 降低百分率：
 
[（N.S. – A.D.）/ N.S.] × 100%

1.  操作要快（为了保证酶的活性）；
 
2.  冰浴（为了保证酶的活性）；
 
3.  血要放尽（P-450 为血红素蛋白；血红素影响P-450）；
 
4.  胆囊破后，胆红素会影响 P-450 的测定；
 
5.  通 CO 的速度不能过快或过慢；
 
6.  研磨，至肝组织由红色变成白色匀浆为止；
 
7.  分光光度计上比色时，先测定A.D，再测定N.S，最后测定Pheno（P－450 由低浓度至高浓度）。