原理
细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。
材料与仪器
金黄色葡萄球菌24h斜面培养物 大肠杆菌24h肉汤培养物
革兰氏染色液 生理盐水
载物玻片 接种环
革兰氏染色液 生理盐水
载物玻片 接种环
步骤
一、方法
1. 按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。准备载物玻片：用镊子从载物片缸中取出经3％盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。
2. 点燃煤气灯：先把煤气灯的煤气孔和通气孔闭上，再把管道的煤气开关打开，然后把煤气灯的煤气口稍稍开放，立即用火柴点燃之，适当调节煤气孔和通气孔，使火焰长度在8~10cm，并能分清内外焰为止。
二、步骤
二、步骤
1. 涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下：
用肉汤培养物涂片：
（1）右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。
（2）将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧红(图1-2)，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。
（3） 用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。
（4） 用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1-3)，此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。
（5） 将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。
（6） 将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。
用斜面培养物涂片：
用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。
2. 干燥
放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。
放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。
3. 固定
用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。
用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。
4. 染色
①将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1 min。
②水洗后加芦戈氏碘液处理(媒染)1 min。
③水洗后用95%酒精脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体无色为止(约需0.5 min)。
④水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5 min。
⑤水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。
染色过程中，水洗要用自来水的细流徐徐冲洗，冲洗涂膜的背面，勿使强水流直接冲到涂膜上。
三、结果观察
使用油镜观察，注意标本中两种细菌的形态、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪种细菌是革兰氏阳性菌(染成紫色)，哪种细菌是革兰氏阴性菌(染成红色)。
将在标本中观察到的细菌形态和染色性，用有色铅笔画出模式图，并附以文字说明。
注意事项
1. 酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。
2. 被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在18~24h之内。
2. 被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在18~24h之内。
常见问题
一、革兰氏染色液的制备
1. 结晶紫染液
用天秤量取结晶紫5 g放乳钵内研碎，一面研磨一面徐徐加入95%酒精使之溶解。加入酒精全量为100 ml，制成酒精饱和液 (原液)。取原液20 ml，与1%草酸铵水溶液80 ml混合，用滤纸过滤。供革兰氏染色初染用。
2. 芦戈氏碘液
碘 1 g
碘化钾 2 g
蒸馏水 300 ml
配法是先用数毫升蒸馏水溶解碘化钾，然后加碘使其全溶解，最后加蒸馏水至300 ml。供革兰氏染色媒染用。
3. 稀释石碳酸复红染液
首先，取碱性复红10 g和95%酒精100 ml，按上述方法同①制成复红酒精饱合液。取复红饱和液10 ml，与5%石碳酸水溶液90 ml混合，用滤纸过滤，再用蒸馏水稀释10倍。供革兰氏染色复染用。
二、常见的与医学有关细菌的革兰氏染色性
来源：丁香实验
