秋水仙素处理法

由于小鼠四肢骨内骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。

1.戴上帆布手套,以脱颈椎法处死小鼠,立即用剪刀剪去大腿处的皮肤和肌肉,连同关节头一起取下两侧股骨和胫骨,剔净其上肌肉,用2%柠檬酸钠溶液洗净。剪去关节头,使其露出骨髓腔,用吸有适量2%柠檬酸钠溶液的注射器,将针头插入骨髓腔,将骨髓用柠檬酸钠溶液吹洗入刻度离心管,反复洗直至骨腔变白。

2.将所得的骨髓细胞悬浮液1000r/min离心10min,吸去上清液,加0.075mol/L KCl 5～8ml,立即用吸管吹打均匀,室温下静置低渗25min。

3.1000r/min离心10min,去上清液,沿管壁加5～8ml甲醇-冰醋酸(3∶1)固定液,立即吹散打匀,静置30min。

4.离心去上清液,留约0.1～0.2ml的沉淀细胞和上清液,用吸管反复轻吸混匀,制成细胞悬浮液。

5.取洁净冰水中预冷的载玻片,稍作倾斜,用吸管吸取一滴上述细胞悬浮液,于载玻片上方适当高度滴在载玻片上,立即吹散吹匀载玻片上细胞,空气干燥。

6.载玻片充分干燥后,用pH6.8的磷酸缓冲液按1份Giemsa原液、9份磷酸缓冲液混匀后染色。材料面向上,用染液覆盖载玻片,染色10～15min,用流水洗去多余染液,再用吸水纸吸干多余水分,干燥后即可镜检。在载玻片上用石炭酸品红染色10min左右也可。

7.在低倍及中倍镜下观察Giemsa染色之后的染色体制片,找出分散适度的中期染色体图像,并在油镜头下仔细观察,熟悉小鼠染色体的形态,统计骨髓细胞染色体数目