肿瘤细胞的软琼脂集落培养实验

最新修订时间：2024-05-13

原理

在体外培养基中由一个祖先细胞增殖形成的细胞团，称之为集落。肿瘤细胞能无限繁殖，所以具有这种能力，而成熟分化的细胞则不能形成集落。

HL-60细胞是一种急性早幼粒细胞白血病细胞，在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中形成集落。二甲基亚砜是一种细胞分化诱导剂，经二甲基亚砜处理后的HL-60细胞按粒系途径定向成熟分化，同时细胞的增殖力降低，几乎全部细胞丧失了软琼脂中形成集落的能力。

材料与仪器

HL-60细胞
小牛血清 RPMI1640培养液台盼兰琼脂二甲基亚砜
超净工作台二氧化碳培养箱显微镜培养瓶吸管酒精灯血细胞计数板多孔培养板

步骤

1. 收集对数生长期的HL-60细胞，先按实验十三测定细胞活力，然后调整细胞浓度，制成300~1 000活细胞/ml 的细胞悬液。

2. 取二个培养瓶每个瓶中加9 ml 调整好浓度的细胞悬液，然后各加入1 ml 3%琼脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混匀。

3. 用微量加样器吸140 ul 二甲基亚砜（MDSO），加到一个瓶中，充分混匀，为实验组，另一瓶不加DMSO，为空白对照组。

4. 取一个16 mm 多孔培养板，每孔加1 ml（35 mm 培养皿需加2 ml）细胞琼脂悬液，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。

5. 在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。

6. 然后移培养板或平皿于CO₂培养箱中37℃进行培养。

7. 培养7~10天，肉眼观察并计数细胞集落。

8. 结果：以肉眼可见的细胞团（含500个以上细胞）作为计数集落的标准。对照组HL-60细胞在含0.3%的软琼脂培养基中生长良好，每个孔中可见有多个集落形成，而实验组HL-60细胞因经二甲基亚砜诱导分化，细胞在软琼脂中的集落形成明显减少。

9. 集落的计数和计算：

（1）集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔

（2）集落形成率=集落数/接种培养细胞总数x100%

注意事项

1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：1）高压蒸汽灭菌15分钟以上，2）干烤消毒140度2小时以上。

2.消化液（pH7.8）或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存。

3.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上。

4.培养基（pH7.2）和血清配制好后要做无菌试验：将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存。

5.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌），至少每月一次。

6.进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，肿瘤细胞培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶（盖）时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。

来源：丁香实验