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考马斯亮蓝法

相关实验:蛋白质含量测定实验

最新修订时间:

原理

考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后,其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下,当溶液中的蛋白质浓度不同时,就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式,而且这种转变有一定的数量关系。一般情况,当溶液中的蛋白质浓度增加时,显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加,因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

材料与仪器

蛋白质样品
牛血清 NaCl 考马斯亮蓝
分光光度计 离心机

步骤

一、试剂与器材
 
1.  试剂
 
(1) 标准蛋白质溶液,用 G-球蛋白或牛血清清蛋白(BSA),配制成1.0 mg/ml和0.1 mg/ml的标准蛋白质溶液。
 
(2) 考马斯亮兰G-250染料试剂:称100 mg考马斯亮兰G-250,溶于50 ml 95%的乙醇后,再加入120 ml 85%的磷酸,用水稀释至1 L。
 
2.  器材
 
 可见光分光光度计、 旋涡混合器、 试管16支。
 
二、操作方法
 
1.  标准方法

(1)取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用1.0 mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 ml,然后用无离子水补充到0.1 ml。最后各试管中分别加入5.0 ml考马斯亮兰G-250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
 
(2) 加完试剂2-5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595,空白对照为第1号试管,即0.1 ml H2O加5.0 ml G-250试剂。
 
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
 
考马斯亮兰法实验表
                 
(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标,用吸光度值A595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线。由此标准曲线,根据测出的未知样品的A595值,即可查出未知样品的蛋白质含量。
 
0.5 mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
 
2. 微量法
 
当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100 mg/ml),可将取样量(包括补加的水)加大到0.5 ml或1.0 ml,空白对照则分别为0.5 ml或1.0 ml H2O, 考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0 ml,同时作相应的标准曲线,测定595 nm的光吸收值。
 
0.05 mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。

注意事项

Bradford法比Lowry法要简单迅速,是测定蛋白质浓度的选用方法。有些物质会干扰这种检测反应,它们是甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、和一些碱性缓冲系统。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除大部分这些干扰物质的影响。

常见问题

一、bradford法的突出优点
 
1.  灵敏度高,据估计比lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。
 
2.  测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。
 
3. 干扰物质少。如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
 
二、bradford法的缺点
 
1.  由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用 G-球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
 
2.  仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Ttriton x-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1 N的氢氧化钠。(如同0.1 N的酸干扰lowary法一样)。
 
3.  标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

来源:丁香实验

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