材料与仪器
cDNA
BHI 氯霉素 NaOH SSC 氯仿 异戊醇 TES SDS mRNA 甲硫氨酸 乙醇 乙酸钠 免疫沉淀缓冲液
转子 硝酸纤维滤膜 离心管 微量多孔洗涤仪
BHI 氯霉素 NaOH SSC 氯仿 异戊醇 TES SDS mRNA 甲硫氨酸 乙醇 乙酸钠 免疫沉淀缓冲液
转子 硝酸纤维滤膜 离心管 微量多孔洗涤仪
步骤
1. 往微量滴定板的每孔中加入250 μl 含适当抗生素的选择性BHI培养液，并分别接种独立的cDNA克隆，37℃温育过夜。
2. 在250 ml 烧瓶中加入50 ml BHI/抗生素培养液，以10个克隆过夜培养液为一组， 从每个微孔中取100 μl 培养液，混合后接种到烧瓶中。
3. 37℃培养至A590=0.7，然后加入氯霉素继续于37℃温育过夜；对每组10个过夜的克隆重复培养。
4. 2 000 g 4℃离心10 min，制备质粒DNA。
2. 在250 ml 烧瓶中加入50 ml BHI/抗生素培养液，以10个克隆过夜培养液为一组， 从每个微孔中取100 μl 培养液，混合后接种到烧瓶中。
3. 37℃培养至A590=0.7，然后加入氯霉素继续于37℃温育过夜；对每组10个过夜的克隆重复培养。
4. 2 000 g 4℃离心10 min，制备质粒DNA。
5. 将制得的约50 μg 质粒DNA溶于1.5 ml TE缓冲液中，移入15 ml无菌、带盖的玻璃培养管中。
6. 沸水浴10 min立即加入1.5 ml 1 mol/l NaOH，室温放置10 min。
7. 加 9 ml 中和液，混匀后置于冰浴，检测pH只值应在6.5~7.5之间。
6. 沸水浴10 min立即加入1.5 ml 1 mol/l NaOH，室温放置10 min。
7. 加 9 ml 中和液，混匀后置于冰浴，检测pH只值应在6.5~7.5之间。
8. 将0.45 μm 孔径的硝酸纤维素滤膜放在一个连于真空泵的多孔滤器上。
9. 以1 ml/min 的速率加入第4步得到的变性DNA液，待所有液体被吸干后继续抽吸3 min。
10. 取出滤膜用50 ml 6×SSC洗涤，然后于80℃真空烤箱中烤膜2 h。
11. 用无菌的单孔打孔器在滤膜上打出直径为5 mm 的圆形小块滤膜，分别用圆珠笔作好标记。
9. 以1 ml/min 的速率加入第4步得到的变性DNA液，待所有液体被吸干后继续抽吸3 min。
10. 取出滤膜用50 ml 6×SSC洗涤，然后于80℃真空烤箱中烤膜2 h。
11. 用无菌的单孔打孔器在滤膜上打出直径为5 mm 的圆形小块滤膜，分别用圆珠笔作好标记。
12. 将盛于无菌带盖的塑料管的含10~50 μg poly（A）+ RNA的0.3 ml 杂交液在70℃预热10 min。
13. 然后将10片小滤膜放入杂交液中，在50℃温育2 h。
14. 将小滤膜转移到50 ml 的试管（每管最多可装20片膜）中，每次用225 ml TES/0.5%SDS冼液于65℃旋转振荡洗涤30 s，共10次，吸去上请。
15. 然后每次用25 ml TES液干65℃洗膜，共2次。
16. 将每片小滤膜分别转移到无菌、硅化的1.5 ml 微量离心管中，每管加入0.3 ml 水、2 μl 10 mg/ml 的酵母tRNA。
17. 置沸水浴中变性60 s，立即置干冰或冷乙醇中速冻。 接着在室温下解冻。
13. 然后将10片小滤膜放入杂交液中，在50℃温育2 h。
14. 将小滤膜转移到50 ml 的试管（每管最多可装20片膜）中，每次用225 ml TES/0.5%SDS冼液于65℃旋转振荡洗涤30 s，共10次，吸去上请。
15. 然后每次用25 ml TES液干65℃洗膜，共2次。
16. 将每片小滤膜分别转移到无菌、硅化的1.5 ml 微量离心管中，每管加入0.3 ml 水、2 μl 10 mg/ml 的酵母tRNA。
17. 置沸水浴中变性60 s，立即置干冰或冷乙醇中速冻。 接着在室温下解冻。
18. 用无菌针挑去滤膜，往每个微量离心管中加入150 μl 饱和酚和150 氯仿/异戊醇，混匀，离心后将水相转移至无菌的微量离心管中。
19. 加入30 μl 3 mol/l 乙酸钠和2 倍体积的无水乙醇，离心沉淀核酸15 min，用0.5 ml 乙醇洗涤一次后冻干。
20. 将此杂交选择的RNA重悬于10 μl 水中。
21. 取5 μl 杂交选择的RNA，加入10 μl 翻译反应混合物，其中含标记的甲硫氨酸， 30℃温育60 min。
19. 加入30 μl 3 mol/l 乙酸钠和2 倍体积的无水乙醇，离心沉淀核酸15 min，用0.5 ml 乙醇洗涤一次后冻干。
20. 将此杂交选择的RNA重悬于10 μl 水中。
21. 取5 μl 杂交选择的RNA，加入10 μl 翻译反应混合物，其中含标记的甲硫氨酸， 30℃温育60 min。
22. 加入15 μl 免疫沉淀缓冲液和1 μl 未经免疫的血清，室温下温育10 min。
23. 加入40 μl 蛋白质A-Sepharose悬液，在室温静置30 min、离心2 min 后将上清移至另一个新的微量离心管中。
24. 加入1 μl 针对相关基因产物的多克隆抗体或单克隆抗体，于室温下温育10 min。
23. 加入40 μl 蛋白质A-Sepharose悬液，在室温静置30 min、离心2 min 后将上清移至另一个新的微量离心管中。
24. 加入1 μl 针对相关基因产物的多克隆抗体或单克隆抗体，于室温下温育10 min。
25. 加入40 μl 蛋白质悬液，于室温反应30 min，离心弃上滑。
26. 依次用1 ml 免疫沉淀缓冲液、1 ml 高盐免疫沉淀缓冲液和1 ml 水冼涤蛋白A-Sepharose微珠。
27. 用20 μl 2×SDS样品缓冲液重悬沉淀，沸水浴10 min。
28. 将吸附在蛋白A-Sepharose微珠上的翻译产物洗下来，离心后等分成15~20 ml 的小份进行变性SDS-PAGE电泳。
28. 将吸附在蛋白A-Sepharose微珠上的翻译产物洗下来，离心后等分成15~20 ml 的小份进行变性SDS-PAGE电泳。
29. 干胶并进行放射自显影曝光。
来源：丁香实验
