材料与仪器
RNA
DEPC MOPS 甲醛 琼脂糖 乙酸铵 NaOH NaCl Tris·Cl 磷酸钠 溴化乙锭 SDS
离心机 电泳仪 培养箱 紫外线透照仪 杂交炉
DEPC MOPS 甲醛 琼脂糖 乙酸铵 NaOH NaCl Tris·Cl 磷酸钠 溴化乙锭 SDS
离心机 电泳仪 培养箱 紫外线透照仪 杂交炉
步骤
1. 用72 ml 水溶解1 g 琼脂糖，在水浴中冷至60℃时，移至通风橱中加入10×MOPS电泳缓冲液和18 ml 12.3 mol/l 甲醛。
（1）5 μl 10×MOPS电泳缓冲液
（2）9 μl 12.3 mol/l 甲醛
（3）25 μl 甲酰胺
（4）在漩涡混合器振荡混匀，并在微量离心机中短暂离心5~10 s 回收液滴，然后在55℃保温15 min。
8. 用吖啶橙染色
（1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。
（2）在含10 μg/l 吖啶橙的1.1 mol/l 甲醛/10 mmo/l 磷酸钠中染色2 min。
（3）在不含吖啶橙的同样液体中脱色20 min。
9. 在紫外线透照仪中使凝胶中的RNA显迹，沿凝胶的边缘放一把尺子拍照，以便随后能确定膜中的条带。
2. 铺制凝胶使之凝固，拔去梳子，将凝胶放进电泳池，加入足够的1×MOPS电泳缓冲液使能淹没凝胶面1 mm 左右。
3. 将每份样品的体积用水调整至11 μl，然后加入：
（1）5 μl 10×MOPS电泳缓冲液
（2）9 μl 12.3 mol/l 甲醛
（3）25 μl 甲酰胺
（4）在漩涡混合器振荡混匀，并在微量离心机中短暂离心5~10 s 回收液滴，然后在55℃保温15 min。
4. 加入10 μl 醛加样缓冲液，在旋涡混合器中振荡，并在微量离心机中稍加离心以回收液滴。
5. 每分样品在一对加样孔中分别加入0.5~10 μg RNA样品，以便可取半片凝胶进行染色显。
6. 在5 V/cm 电压降下电泳至溴酚蓝染料泳动了凝胶长度的一半或三分之二。
5. 每分样品在一对加样孔中分别加入0.5~10 μg RNA样品，以便可取半片凝胶进行染色显。
6. 在5 V/cm 电压降下电泳至溴酚蓝染料泳动了凝胶长度的一半或三分之二。
7. 用溴化乙锭染色
（1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。
（2）放置于无RNa酶的玻璃平血，加 入足够量的0.5 mol/l 乙酸铵覆盖，浸泡20 min 换液再泡20 min 以除去甲醛。
（3）倾去液体，加入含0.5 μl /ml 溴化乙锭的0.5 mol/l 乙酸铵，染色40 min。
（4）必要时以0.5 mol/l 乙酸铵脱色1 h。
（1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。
（2）放置于无RNa酶的玻璃平血，加 入足够量的0.5 mol/l 乙酸铵覆盖，浸泡20 min 换液再泡20 min 以除去甲醛。
（3）倾去液体，加入含0.5 μl /ml 溴化乙锭的0.5 mol/l 乙酸铵，染色40 min。
（4）必要时以0.5 mol/l 乙酸铵脱色1 h。
8. 用吖啶橙染色
（1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。
（2）在含10 μg/l 吖啶橙的1.1 mol/l 甲醛/10 mmo/l 磷酸钠中染色2 min。
（3）在不含吖啶橙的同样液体中脱色20 min。
9. 在紫外线透照仪中使凝胶中的RNA显迹，沿凝胶的边缘放一把尺子拍照，以便随后能确定膜中的条带。
10. 将非染色的部分凝胶放置于无RNA酶的玻璃平皿，加足够的去离子水浸洗几次以除去甲醛。
11. 凝胶浸泡在10倍体枳的0.05 mol/l NaOH/1.5 mol/l NaCl中30 min，使RNA部分水解。
12. 接着浸泡于10倍体积的0.5 mol/l Tris·Cl（pH7.4）/1.5 mol/l NaCl缓冲液中和30 min。
13. 将溶液换成10倍体枳的20×SDS，浸泡45 min。
12. 接着浸泡于10倍体积的0.5 mol/l Tris·Cl（pH7.4）/1.5 mol/l NaCl缓冲液中和30 min。
13. 将溶液换成10倍体枳的20×SDS，浸泡45 min。
14. 在玻璃或塑料平皿中放置一比凝胶略大的矩形海绵（必要时，可并排放两块或更多）加入足够的20×SDS以使海绵半淹没在液体中。
15. 构筑转移平台，剪3张与海绵同样大小的Whatman 3 MM 滤纸，放在海绵表面，并以20×SDS润湿。
16. 把凝胶置于滤纸表面，用玻璃吸管在其表面滚动挤压去除气泡，切4条塑料保鲜瞋覆盖在凝晈的边缘。
17. 剪一片与凝胶暴露面枳大小相当的尼龙膜或硝酸纤维素胶膜，在一个无RNA酶的玻璃平皿中加入约0.5 mm深的去离子水，将膜漂住水面使之润湿，直至膜沉没在水中。
18. 如果是尼龙膜，只需让膜在水中泡上5 min，如杲是硝酸纤维素膜，换成20×SDS再浸泡10 min。
19. 将润湿了的膜放在凝胶表面，排去气泡，以20×SDS洗膜表面。
20. 切5张与膜大小相 当的Whatman 3 MM 滤纸，放于膜的表面。
21. 然后将切得如膜大小相当的纸巾整齐地堆放在滤纸的表面，高约4 cm。
22. 在纸堆的顶部放一块玻璃平板，压一重物（0.2~0.4 kg），放置过夜。
23. 拆卸转移装置，回收膜和压扁了的凝胶，在膜上用铅笔标上加样孔的位置和方向。
24. 用2×SDS洗膜，然后放在一张Whatman 3 MM 滤纸上，让膜完全干燥
25. 硝酸纤维素膜的处理：将膜夹在两张Whatman 3 MM 滤纸中，80℃真空烤膜2 h。
26. 尼龙膜的处理：如上述方法烤膜或将干的膜包在能透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外线透照仪照射合适的时间。
（1）2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min。
（2）0.2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min（低严谨度洗涤）。
（3）于42℃预热0.2×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15 min（中严谨度洗涤，可选）。
（4）于68℃预热0.1×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15 min（高严谨度洗涤，可选）。
15. 构筑转移平台，剪3张与海绵同样大小的Whatman 3 MM 滤纸，放在海绵表面，并以20×SDS润湿。
16. 把凝胶置于滤纸表面，用玻璃吸管在其表面滚动挤压去除气泡，切4条塑料保鲜瞋覆盖在凝晈的边缘。
17. 剪一片与凝胶暴露面枳大小相当的尼龙膜或硝酸纤维素胶膜，在一个无RNA酶的玻璃平皿中加入约0.5 mm深的去离子水，将膜漂住水面使之润湿，直至膜沉没在水中。
18. 如果是尼龙膜，只需让膜在水中泡上5 min，如杲是硝酸纤维素膜，换成20×SDS再浸泡10 min。
19. 将润湿了的膜放在凝胶表面，排去气泡，以20×SDS洗膜表面。
20. 切5张与膜大小相 当的Whatman 3 MM 滤纸，放于膜的表面。
21. 然后将切得如膜大小相当的纸巾整齐地堆放在滤纸的表面，高约4 cm。
22. 在纸堆的顶部放一块玻璃平板，压一重物（0.2~0.4 kg），放置过夜。
23. 拆卸转移装置，回收膜和压扁了的凝胶，在膜上用铅笔标上加样孔的位置和方向。
24. 用2×SDS洗膜，然后放在一张Whatman 3 MM 滤纸上，让膜完全干燥
25. 硝酸纤维素膜的处理：将膜夹在两张Whatman 3 MM 滤纸中，80℃真空烤膜2 h。
26. 尼龙膜的处理：如上述方法烤膜或将干的膜包在能透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外线透照仪照射合适的时间。
27. 如需要的话，凝胶可按步骤7或8操作，用溴化乙锭或吖啶橙染色以检查转印效率，或在含0.03%（w/v）亚甲蓝的0.3 mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液中染色45 s，在水中脱色2 min。
28. 制备放射比活在108 dpm 以上的寡核苷酸探针，并除去未标的寡核苷酸。
29. 用6×SSC液润湿携带RNA的膜。
28. 制备放射比活在108 dpm 以上的寡核苷酸探针，并除去未标的寡核苷酸。
29. 用6×SSC液润湿携带RNA的膜。
30. 将膜带RNA的面朝上，放入杂交管中，毎10 cm2 面积加入1 ml 甲酰胺预杂交液/ 杂交液，杂交管在杂交炉中旋转保温3 h 温度设定在42℃（DNA探针）或60℃（RNA探针）。
31. 如果是双链探针的话，需在水浴或加热器中加热至100℃，保温10 min，移至冰上。
32. 吸所需要体积的探针加入杂交管中，在杂交炉中于42℃（DNA探针）或60℃（RNA探针）旋转过夜。
32. 吸所需要体积的探针加入杂交管中，在杂交炉中于42℃（DNA探针）或60℃（RNA探针）旋转过夜。
33. 倒出杂交液，按以下程序依次洗膜：
（1）2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min。
（2）0.2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min（低严谨度洗涤）。
（3）于42℃预热0.2×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15 min（中严谨度洗涤，可选）。
（4）于68℃预热0.1×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15 min（高严谨度洗涤，可选）。
34. 在室温以2×SSC洗膜，吸干多余液体，盖上可透过紫外线的塑料保鲜膜，并进行放射自显影。
来源：丁香实验
