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Ethidium bromide染色法

相关实验:核酸纯度、浓度与分子量测定实验

最新修订时间:

原理

利用一系列不同浓度的DNA标准溶液(0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/ml),或已知浓度的DNA marker,和未知浓度DNA样品一起进行琼脂糖凝胶电泳,以EB染色后,在凝胶图象分析仪上观察,比较标准浓度及未知浓度的亮度,来求取DNA 的含量;比较DNA样品与DNA marker条带位置,推知DNA 样品分子量。

材料与仪器

DNA
琼脂糖 TBE电泳缓冲液 TE buffer 溴化乙锭(EB) 载样缓冲液
电泳仪 电泳槽 电子天平 移液器 枪头 点样板 微波炉 紫外分光光度仪 凝胶图象分析仪

步骤

1.  称取1.5 g 琼脂糖加入盛有100 ml 0.5xTBE电泳缓冲液三角瓶中,摇匀,在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。加入溴化乙锭(EB)至终浓度0.5 ug/ml,并摇匀。 

2.  用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解的琼脂糖倒入,室温冷却凝固。 

3.  充分凝固后撕掉两端的胶布,垂直向上小心拔出梳子,以保证点样孔完好。凝胶置入电泳槽中,加0.5xTBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1~2 mm。

4.  用移液器吸取DNA样品 8 ul 与 2 ul 的载样缓冲液混匀,小心加入点样孔,蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10 ul DNA Marker作为分子量标准。 

5.  打开电源开关,调节电压至3-5 V/cm,可见到条带由负极向正极移动,约半小时后即可观察。 

6.  在凝胶图象分析仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小;同时比较标准浓度及未知浓度的亮度,求取DNA 的含量。

注意事项

1.  A260/A280>1.8表示DNA/RNA的纯度高。若数值<<1.8,表示纯度低,这时由OD260测得的DNA含量较不可信,核酸溶液中含有较多蛋白质,因此最好将前述所得核酸再重新抽取。
 
2.  测定260 nm 吸光值,OD=1.0代表值如下:
 
(1)ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml
 
(2)ss DNA (single stranded DNA or simgle-stranded RNA) = 40 mg/ml
 
(3)oligonucleotide = 33 mg/ml
 
3.  EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。

来源:丁香实验

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