原理
材料与仪器
DMEM 胎牛血清 内皮细胞生长因子 肝素钠 青链霉素 明胶 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液
手术器械 眼科剪 眼科镊 培养皿 手术刀 培养瓶 CO2培养箱
步骤
1. 颈椎脱臼处死大鼠，将整个大鼠浸泡于75%乙醇中消毒约1 min。在无菌状态下，逐层剪开胸腔，分离取出主动脉，放含无菌 D-Hanks’液培养皿中。
2. 用眼科剪、镊尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织。然后，用含抗生素的D-Hanks’液冲洗血管的外表面及血管腔内的凝血数次，再放入另一无菌培养皿中。
3. 用眼科剪纵向剪开血管，平展在培养皿中。用非常锐利的手术刀将其切成1 mm3大小的动脉植 块(或者用剪刀剪，依照个人习惯)，然后种植到培养瓶或培养皿(培养瓶或皿用1%明胶预置 37℃下过夜， 使用前2h 移入CO2培养箱中。用时可以先经含 10%小牛血清的培养液冲洗)。将动脉植块的内膜面与瓶底接触，种植密度约为 1 块/cm2 。
4. 置培养箱中静置2 h(干贴壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培养液，液量以略盖过动脉植块内膜面，而又不使植块漂浮为宜。24 h 后，更换培养液，加入 2-3 ml 培养液。
5. 72 h 左右的时候，当观察到内皮细胞充分长出，而成纤维细胞刚要长出的时候，将动脉植块除去，刮除成纤维细胞，换培养液1 次。以后每2 天换液一次，每次换1/2~1/3 的液量。继续培养 8-10 d， 细胞融合成单层，即可传代。
注意事项
1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞盖住，以防止细菌落入。
4. 操作前要洗手，进入超净工作台后要用75％酒精或0.2％新洁尔灭擦拭手。试剂瓶口也要擦拭。
5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，且冷却后才能夹取组织。吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分，工作台面上的用品摆放要布局合理。
8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
常见问题
1. 在合适的时间去除动脉块，即当内皮细胞已经爬出，初具规模时(大概在72 h 左右的时候，按照本文的培养液条件，因为有生长因子，内皮容易爬出和增殖)，去除动脉块，并刮除成纤维细胞。
2. 使用含肝素的培养液(在培养液中加入100 U/ml 的肝素)，可使内皮细胞纯度提高；
3. 高浓度的血清和50 µg/ml ECGF 可以充分地促进内皮细胞增殖，而使内皮细胞成为优势细胞。另外，动脉植块干贴壁的时间不宜超过2 h，而加培养液这一步骤尤为关键，过少会使内膜接触不到培养液，过多则易使动脉小块漂浮，导致贴壁失败。因此，干贴壁后加培养液，加入少量高营养的培养液(0.5-1 ml)，可以避免这些问题。
来源：丁香实验
