原理
采用SCID 小鼠皮下接种107 细胞可成功地建立人人弥漫性大B 细胞淋巴瘤（DLBCL ）移植瘤模型，成瘤率70%，肿瘤的组织学表现类似于人DLBCL。
材料与仪器
SPF 级SCID 小鼠
RPMI 1640培养液 青霉素 谷氨酰胺 链霉素 CD19 APC抗体 CD20 PE抗体 CD24 PE抗体 山羊抗兔IgG FITC
流式细胞仪 离心机 水浴 培养瓶 冰箱 注射器 离心管 封口膜 微量移液器
RPMI 1640培养液 青霉素 谷氨酰胺 链霉素 CD19 APC抗体 CD20 PE抗体 CD24 PE抗体 山羊抗兔IgG FITC
流式细胞仪 离心机 水浴 培养瓶 冰箱 注射器 离心管 封口膜 微量移液器
步骤
一、细胞培养
1. SUDHL-4为人GCB 样DLBCL细胞株。将初始密度为2.5x105 /ml 细胞置于含10% FBS、100 U /ml 青霉素、100 ug/ml 链霉素、30 ug/ml 谷氨酰胺的RPMI1640 培养液的T25 细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养。
2. 待2-3 d 第1 次传代后，转入T75 细胞培养瓶，以后根据细胞生长情况适时移入T150 细胞培养瓶。
2. 待2-3 d 第1 次传代后，转入T75 细胞培养瓶，以后根据细胞生长情况适时移入T150 细胞培养瓶。
二、流式细胞术检测样品的制备
1. 取对数生长期的SUDHL-4 细胞，用无血清PBS 漂洗2 遍后，于PBS /2% FBS 中制成细胞悬液( 1 x107 /ml) 。
2. 根据说明书建议的适宜浓度加入相应抗体，4℃避光孵育15 min；若需胞内染色，则先采用1% 多聚甲醛对细胞进行固定，然后用破膜剂( 0.25% Saponin) 处理，同时加抗体进行染色，4℃避光孵育过夜。
3. 细胞用PBS /2% FBS 漂洗1遍，悬于200 ul PBS 待测。
4. 流式细胞仪检测时每份样品均测定3x105 细胞，用FlowJo 软件对检测结果进行分析。
2. 根据说明书建议的适宜浓度加入相应抗体，4℃避光孵育15 min；若需胞内染色，则先采用1% 多聚甲醛对细胞进行固定，然后用破膜剂( 0.25% Saponin) 处理，同时加抗体进行染色，4℃避光孵育过夜。
3. 细胞用PBS /2% FBS 漂洗1遍，悬于200 ul PBS 待测。
4. 流式细胞仪检测时每份样品均测定3x105 细胞，用FlowJo 软件对检测结果进行分析。
三、实验动物
1. SPF 级SCID 小鼠，雌性，5 周龄，体重16-20 g随机分组，饲养及实验均在恒温( 20 - 26℃) 、恒湿( 50% -56%) 的SPF 级鼠房内进行。
2. 小鼠置于层流架带盖鼠盒中，空气经中效过滤，喂食标准颗粒饲料，与鼠接触的一切物品均事先经灭菌处理。
2. 小鼠置于层流架带盖鼠盒中，空气经中效过滤，喂食标准颗粒饲料，与鼠接触的一切物品均事先经灭菌处理。
四、细胞接种
1. 取对数生长期的SUDHL-4 细胞，用无血清PBS 漂洗2 遍后，悬浮于无血清PBS。
2. 实验组小鼠( 每组10 只) 在其一侧肋部皮下接种0.1 ml 含107 细胞的细胞悬液； 2 个成瘤对照组分别为每组3 只，在右侧肋部皮下接种0.1 ml 分别含5 × 106 细胞和1 x106细胞的细胞悬液； 正常对照组( 每组10 只) 在右侧肋部皮下注射0.1 ml PBS。
3. 接种前小鼠不经任何处理。
2. 实验组小鼠( 每组10 只) 在其一侧肋部皮下接种0.1 ml 含107 细胞的细胞悬液； 2 个成瘤对照组分别为每组3 只，在右侧肋部皮下接种0.1 ml 分别含5 × 106 细胞和1 x106细胞的细胞悬液； 正常对照组( 每组10 只) 在右侧肋部皮下注射0.1 ml PBS。
3. 接种前小鼠不经任何处理。
五、荷瘤鼠指标检测
1. 实验期间每日观察小鼠一般情况、成瘤及肿瘤生长情况。
2. 每日测量体重和肿瘤长短径和高度，并计算肿瘤体积( 计算方法：π/6 x 长x 宽x 高) ；当瘤体达到1 200 mm3 时视为人道终点。
3. 小鼠经麻醉并拉颈处死后，先观察体表各部位成瘤情况；然后解剖动物，观察各内脏器官和淋巴结转移情况。
4. 取下肿瘤，置于10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡切片，HE 染色观察。
2. 每日测量体重和肿瘤长短径和高度，并计算肿瘤体积( 计算方法：π/6 x 长x 宽x 高) ；当瘤体达到1 200 mm3 时视为人道终点。
3. 小鼠经麻醉并拉颈处死后，先观察体表各部位成瘤情况；然后解剖动物，观察各内脏器官和淋巴结转移情况。
4. 取下肿瘤，置于10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡切片，HE 染色观察。
六、统计学处理
实验数据以均数± 标准差( X± SD) 表示，采用SPSS11.5 统计软件包处理，各组样本均数比较采用单因素方差分析( ANOVA) 。
注意事项
在不同条件下对SUDHL-4 细胞进行培养后发现，10%为相对适合的血清浓度。有文献报道，人DLBCL 细胞株体外培养建议采用Iscove' sMEM。本实验证明，采用加入10% FBS 的RPMI1640 培养，细胞生长良好，传代速度适中，4－ 5 代的细胞活力旺盛，具有较高的接种成功率，且适于进行流式分析等其他实验。
常见问题
虽然WHO 将DLBCL 列为一类独立的病种，但其在流行病学、临床特征、组织形态学、分子遗传学和免疫表型、对治疗的反应及预后等多方面，均表现出明显的异质性。DLBCL 的免疫表型十分复杂，且与预后的关系非常密切。研究与肿瘤细胞发生、发展相关的蛋白表达，不仅在DLBCL 的诊断分型、预后评估以及临床治疗中均具有重要的指导意义，而且有助于淋巴瘤发病机理的阐明，及特异性靶向治疗药物的研发。尽管此前曾有少量文献报道针对人类来源的DLBCL 细胞株SUDHL-4 的研究，本实验对SUDHL-4 细胞体外培养的生物学特性和相关标记物表达进行了研究，并建立了稳定的基于SUDHL-4 细胞的人DLBCL 动物模型。
来源：丁香实验
