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电穿孔转化感受态E.coli TG1细胞的制备

相关实验:电穿孔转化感受态 E.coli TG1 细胞的制备

最新修订时间:

原理

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。

材料与仪器

TG1细胞
NaCl 胰化蛋白胨 酵母提取物 去离子水 KCl NaOH 葡萄糖溶液 MgCl2 甘油
恒温旋转式摇床 三角烧瓶 离心管 低温高速离心机

步骤

一、试剂配制


SB培养基


细菌培养用胰化蛋白胨     20g

细菌培养用酵母提取物       5g

NaCl                                0.5g

去离子水                       950ml

250mmol/L KCl溶液         10ml


二、操作步骤


1. 从新鲜的LB平板培养物中挑选一个TG1克隆,接种于10ml SB培养基中。


2. 37℃摇床培养过夜。


3. 取2.5ml培养物转接于0.5L SB中,另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。


4. 37℃培养直到OD600=0.7~0.8。


5. 将培养物置于冰浴15min,然后4000r/min于4℃离心20min,弃上清。


6. 将菌体重悬于1/2体积的预冷10%甘油中,4000r/min于4℃离心20min,弃上清。


7. 重复第(6)步骤。


8. 将菌体重悬于15ml 10%甘油,并转移至一支50ml的离心管中。3500r/min于4℃离心15min。小心地去掉上清,得到4~5ml细菌。迅速地将其吹打重悬;


9. 分装成200μl或40μl 的小份,操作应在乙醇/干冰浴中进行。贮存于-70℃。


10. 用pUC19质粒测试制备感受态细菌的转化效率,应达到109cfu/μg DNA。

注意事项

1. 挑选低代数的菌种是关键,千万不要每次活化后保存活化后的菌种,更不要将菌种长期保存在-20度。


2. 大肠杆菌在平板上过夜生长后,可置冰箱中保存一个月左右;接种新鲜的菌落或菌液有利于细菌细胞的同步快速生长,从而使细菌群体在达到一定的OD值后(0.375)大部分细胞都处于感受态。


3. 大肠杆菌的生长需要氧气,剧烈振荡的目的是提高培养基的溶氧量以利于细菌的生长。


4. 达到细菌对数生长早、中期,需时约2.0~2.5小时,此步骤至为关键,若超过此阶段,则转化效率急剧下降。


5. 低温操作的目的是使细胞不再生长,保持其感受态。


6. 洗涤细胞时细胞较脆弱,悬浮沉淀时动作要轻,可用移液枪轻轻吸打。


7. -80℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后,转化率很快降低。可用一已知标准及浓度的闭环质粒如pUC18/19鉴定感受态细胞的转化能力。

常见问题

来源《工业微生物实验技术手册》

来源:丁香实验

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