弗氏佐剂免疫法

当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分-抗原决定簇相结合。

将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。

免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。

一、实验材料准备

1. 免疫动物：两只新西兰兔。

2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。

3. 免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200 μg免疫原。

二、实验步骤

1. 免疫

用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

2. 取血

用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。

3. 周期性免疫和放血

（1）第0星期

采血2 ml（获得0.5-1 ml免疫前血清），完全弗氏佐剂（CFA）混合的200 μg抗原免疫兔。

（2）第2星期

完全弗氏佐剂（CFA）混合的200 μg抗原免疫兔。

（3）第4星期

不完全弗氏佐剂（IFA）混合的100 μg抗原免疫兔。

（4）第5星期

取检测血清20-30 ml，取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在生理盐水中的100 μg抗原免疫兔。

（5）第6星期

如果检测阳性第一次采血20-30 ml，溶解在生理盐水中的100 μg抗原免疫兔；如果上次检测是阴性，取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测。

（6）第7星期

第二次采血20-30 ml，溶解在生理盐水中的100 μg抗原免疫兔；如果检测仍为阴性，需要讨论这个项目是否继续。

（7）第8星期

第三次采血20-30 ml，溶解在生理盐水中的100 μg抗原免疫兔。

（8）第9星期

末次放血20-30 ml，纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150 mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。