原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
材料与仪器
动物血清样品
硫酸铵 NH4OH PB液 BaCl2溶液 纳氏液 洗脱液 生理盐水
透析袋 离心机 烧杯 搅拌棒
硫酸铵 NH4OH PB液 BaCl2溶液 纳氏液 洗脱液 生理盐水
透析袋 离心机 烧杯 搅拌棒
步骤
一、材料与试剂配制
1. 动物血清
2. 硫酸铵饱和溶液
硫酸铵：800 g~850 g
H2O ：1 000 ml
加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28% NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3. 0.01 mol/L pH7.4 PB液
A液：0.10 mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O ：15.60 g
加H2O至1 000 ml
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O： 35.80 g
加H2O至1 000 ml
取A液19 ml，B液81 ml加水至1 000 ml即可。
4. 1%BaCl2溶液
5. 纳氏液
HgI ：115.00 g
KI： 80.00g
加H2O至500.00 ml
溶化后过滤，然后再加20%NaOH 500.00 ml，混合即可。
6、0.50 mol/L的HCl液和0.50 mol/L的NaOH液
7、洗脱液
0.03 mol/L的NaCl液。
8、透析袋（或玻璃纸）
二、操作方法
1. 取20 ml血清，加生理盐水20 ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10 ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30 min。
2. 3 000 r/min离心20 min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3. 在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30 ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30 min。
4. 3 000 r/min离心20 min，弃上清。
5. 于沉淀中加20 ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液10 ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30 min。
6. 3 000 r/min离心20 min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。
7. 用10 ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。
8. 透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24 h，中间换液数次。
以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 （取3~4 ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4 存在），直至无SO42-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9. 离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。
10. 过DEAE－纤维素层析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS（0.03 mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。
11. 蛋白质及其定量鉴定。
12. IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。
（1）区带电泳
玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。
（2）琼脂双相双扩散鉴定
预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
（3）免疫电泳鉴定
孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。
（4）圆盘电泳鉴定
用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。
13. IgG的浓缩与保存
（1）IgG的浓缩
（2）IgG的保存
一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。
注意事项
一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。
常见问题
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
来源：丁香实验
