克隆化酵母DNA的操作实验
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简介
来源：丁香实验
操作方法
1. 将待研究的基因亚克隆到YIP质粒。 2. 用限制性内切酶在克隆化基因内部切开，使质粒线性化。 3. 用1~10 μg DNA加上担体DNA转化适合的菌株，通过质粒上带的标记进行选择，在选择培养基上纯化几个转化子，制备DNA，应用Southern 杂交确证整合是否发生在所期望的位点，并且测定是否发生了多重整合。
基因置换技术一、整合性破坏 1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。 2. 在此内部片段中将质粒线性化。 3. 继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。 二、基因破坏一步法 1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。 2. 采用合适的限制性位点，从步骤1抅建的质粒中切出含有被破坏基因的片段，凝胶电泳纯化。用1~10 μg 凝胶纯化片段进行转化并
基本方案（质粒缺口修复）1. 将目的基因亚克隆到YRp质粒，通过基因内的两个限制性位点在基因中创造一个缺口区，在缺口两侧留下≥100~250 bp 的同源区，凝胶电泳纯化质粒骨架大片段。 2. 用1~10 μg缺口质粒DNA转化待拯救的含突变等位基因的酵母菌株，通过YRp质粒上的选择基因进行选择，应用质粒分离除去技术鉴定选择标志不稳定的转化子。 3. 在不稳定的转化子中，筛选那些仍然显示突变表型的
基本方案（穿梭质粒）1. 构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株，及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。 2. 将必需基因亚克隆到YCp载体（带有URA3以外的选择标志），取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。 3. 转化至步骤1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省却成分平极上，选择YCp质粒，于允许温度下培养（通常为25℃）。 4. 将每一个转化平板影印到两个带有5-F
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