分析蛋白质-DNA 相互作用的甲基化和尿嘧啶干扰分析法实验

实验分类：

生物化学实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

干扰实验（甲基化和尿嘧啶）可识别DNA结合位点上的特异残基。这些残基经修饰后，可干扰蛋白质与DNA的结合。来源：《精编分子生物学实验指南》第五版

来源：丁香实验

操作方法

甲基化干扰分析法

1) 制备单末端标记的DNA探针。2) 取约106 cpm的探针溶于5〜10μL TE缓冲液中。加入200μL DMS反应缓冲液及 1μl DMS。在祸旋混合器上充分混匀。室温温育5 min。注意：DMS是一种强毒性物质，必须在通风橱内小心操作。含有DMS的液体应倒在指定的 DMS废液瓶中，接触过DMS的吸液头应放入一个专门的DMS固体废物瓶中，由安全部门处理。3) 在探针混合液中加入以下试剂：4

尿喀啶干扰分析法

1）用T4噬菌体多核苷酸激酶进行32P标记寡核苷酸引物的5'端设计用来进行PCR扩增的引物，使其包含蛋白质结合位点旁侧的序列，并位于两条互补链上。2) 设立2个平行的含有以下试剂的50μL PCR反应：5μL含有结合位点的DNA片段（0.2 pmol)5μL 32P标记的寡核苷酸引物（20 pmol)5μL另一条寡核苷酸引物（非标记，20 pmol)5μL 2 mmol/L 4种dNTP 混合液5