氨基酸序列测定实验

实验分类：

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

氨基酸，是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物，化学式是 RCHNH2COOH。羧酸碳原子上的氢原子被氨基取代后形成的化合物。

氨基酸测序是一个古老的话题，早在 20 世纪 30 年代就已经开始使用各种方法研究氨基酸和多肽。

原理

氨基酸测序分为N端测序和C端测序，原理是用氨肽酶（N端测序法）或羧肽酶（C端测序法）将肽链从一端依次切下，并在一段时间内检测切下的氨基酸的种类（时间过长则会出现多种氨基酸），并且重复该过程。

来源：丁香实验

操作方法

测定通过 SDS-PAGE 转移到 PVDF 膜上样品的氨基酸序列

1. 如蛋白质电泳实验中所述，以分离胶和积层胶溶液灌制变性微型凝胶。在加入过硫酸铵和 TEMED 之前脱气，小心不要在转移或吸取液体时把空气带入聚合混合物中。如果加样孔不是矩形和结实的，则需重新灌制。2. 组装垂直凝胶电泳装置。3. 将 80 ml 4 × 凝胶缓冲液稀释至 320 ml（总浓度是 1 × 凝胶缓冲液）。将 200 ml 1 × 凝胶缓冲液倒入下层缓冲液槽。剩余的 1 × 凝胶缓冲

辅助方案准备SDS-PAGE蛋白质样品

1. 必要时，用1 mol/L NaHCO3将蛋白质样品的盐浓度调至 > 100 mmol/L。2. 用超滤浓缩（按厂商说明）或真空浓缩（关键是当释放真空时，不要引入空气中的残屑）将样品体积浓缩至 50~100 μl, 移入 1.5 ml 微量离心管。3. 样品加入 9 倍体积的冰冷 100％乙醇。在干冰中放置 1 h，或 -20°C 过夜。许多样品在这步就可以永久保存了。4. 在最大速度