金属螯合亲和层析实验

实验分类：

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

经遗传工程改造的使其氨基端或羧基端带上6个连续的组氨酸残基的重组蛋白，可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子固相化的层析介质加以提纯，是为金属螯合亲和层析。

来源：丁香实验

操作方法

天然MCAC纯化带组氨酸尾的可溶性融合蛋白

1. 接种含以pET载体表达带组氨酸尾融合蛋白的大肠扦菌BL21（DE3）pLyaS菌株于10 ml M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基。于37℃摇荡培养过夜。 2. 转接1 ml 过夜培养物于100 ml M9ZB/氨苄青霉索/氯霉素培养基，于37℃揺荡培养至OD600=0.7~1.0。 3. 加入1 ml 0.1 mol/l IPTG，干37℃继续培养1~3 h。

变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白

1. 制备表达带组氨酸尾的融合蛋白的大肠杆菌菌体沉淀。 2. 准备NTA介质层析柱，但柱子最后以GuMCAC-0缓冲液洗涤. 3. 在冰浴中冻融菌体沉淀。加5 ml GuMCAC-0缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声破菌或匀浆。在-70℃冻结10 min，室温冻融。 4. 用振摇器、旋转混合器或磁力搅拌器轻柔地混匀样品60 min，在4 ℃ 27 000 g 离心30 m