差异显示聚合酶链反应(PCR) 可促进在诸多物种中与污染暴露相关的新分子标志物的鉴定。至今,已有多种差异显示方法被详细描述。这里,我们描述了一种改良的RNA 随机引物触发的 PCR 方 法(RNAarbitrarily primed PCR, RAP-PCR) , 主要涉及通过 罗 丹 明(rhodamine) 标 记 的 18 碱基的随机引物对 cDNA 转录物进行荧光标记 。这些随机引物特异结合于 cDNA 的编码区,因此简化了下游对毒物响应基因的鉴定 。这种方法被命名为突光 R N A 随机引物触发的 PCR (fluorescent RNA arbitrarily
primed PCR) , 即 FRAP-PCR,该方法已被成功用于几种禽类和来源于培养细胞和组织等 的 RNA。这种直接、安全、低成本的方法是对基于放射标记的 RAP-PCR 方法的有效替代。
作者:马丁,本实验来自「环境基因组学实验指南」
荧光RNA随机引物触发的聚合酶链反应实验##一、 从组织和培养细胞中分离RNA
1.TRIzol试 剂(Invitrogen)。该试剂含有苯酚和硫氰酸盐化合物,操作时应穿实
验服,戴手套,存放于 4°C 。
2.氯仿。
3.异丙醇。
4.乙醇。
5.焦炭酸二乙酯(DEPC) 处理的水。
6.无DNA试剂盒(Ambion)。贮存于一 20°C 。
##二、 CDNA 合成
1.Superscript™ II, RNase