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短串联重复序列的 PCR

实验分类:

PCR 技术

别名:

short tandem repeats,STR

最新修订时间:

简介

短串联重复序列 (short tandem repeats, STR) 的 PCR,也称微卫星 DNA (microsatellites) 或简单重复序列 (simple sequence repeats, SSR) 的 PCR,它的重复序列很小,其核心序列只有 2〜6bp ,重复次数通常为 15〜30 次。STR 广泛存在于真核生物基因组的编码区和非编码区中,其中以 dA-dC、 dA-dA-dN、dC-dA 和 dA-dG 为核心序列的 STR 最常见,最早发现的 STR 是由 dT-dG 串联重复组成的长度可变序列。由于 STR 的核心序列重复次数在个体间存在差异,而且这种差异在基因传递的过程中一般遵循孟德尔共显性遗传规律和 Hardy-Weinberg 平衡,因此,大多数 STR 基因座具有多态性,STR 与其它 DNA 重复序列家族成员的比较见表 13-4。目前,用于短串联重复序列的 PCR 的方法主要有 1 种:短串联重复序列 PCR。

原理

短串联重复序列的 PCR 的基本原理是:在人类基因组中,STR 是高度多态性标记的丰富来源,可采用 PCR 反应检测。目前 STR-PCR 技术已形成多位点检测方法,即在同一分析反应试管中同时扩增来自两个或更多的位点的等位基因(图 13-3), 扩增的重复序列由于重复次数的差异导致 STR 基因座的等位基因分型不同,在电泳分离后,用放射性同位素、银染或荧光检测可区别不同的基因型。检测时需注意:
① PCR 的模板 DNA 区域必须包括 STR DNA 的侧翼区序列,DNA 总长度为 100〜400bp;
② 进行多基因座同时扩增时,根据不同的基因座序列设计不同的特异引物,特异引物可采用荧光素标记(FL)、梭基-四甲基罗丹明标记(TMR)或 6-羧基-4',5'-二氯-荧光素(JOE)等标记;
③ 在单管中对所有基因座同时扩增后,通过单一进样或单一胶道在遗传分析仪及 DNA 测序 仪上进行电泳分析。
与扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism, AMP-FLP) 和可变数目串联重复序列 (variable number of tendem repeat, VNTR) 等分型方法相比,STR 基因分型方法所扩增的产物长度小得多 (小于 500bp), 因此更适合于对降解的 DNA 模板进行分析。此外,STR 分型适用于多种 DNA 纯化方法得到的 DNA, 这些 DNA 的量往往较少而不够作 Southern 印迹分析。
STR-PCR 产物具有不连续的可分离的长度,可以用每个基因座的几个或所有等位基因的片段构建成等位基因阶梯 (allelic ladder), 肉眼观察或利用仪器比对同一基因座的等位基因阶梯和扩增样品,可快速和准确地确定等位基因座。试验中仔细选择的 STR 基因座和引物可以避免或减少伪带的产生,包括与 RqDNA 聚合酶相关的影子带及末端核昔酸的减少。影子带,有时称为「n-4 带型」、「鬼带」或「暗带」,是由于 DNA 扩增中缺失了一次重复,或样品中 DNA 本身的改变,或二者的结合,它的出现主要与基因座本身和重复的 DNA 序列有关;通常的 PCR 反应中,由于 Taq DNA 聚合酶以不依赖于模板的方式会在扩增的 DNA 片段的 3』末端添加核苷酸,一般是腺苷酸,发生这一现象的频率取决于不同的引物序列;STR-PCR 产物有时常观察到比预计少一个碱基的假带 (无末端添加),因此将引物序列进行修饰,并在扩增流程的最后 一步,加入 60°C 延伸 30 min 的步骤,可使在所用的 DNA 模板上得到完全的末端核苷酸添加。 此外,微变化等基因座 (基因座间相差的长度不是重复次数所致) 的存在常使等位基因座的解释 和确认变得复杂,这和高度多态性、趋向微变化以及突变率的增加相关。

应用

短串联重复序列的 PCR 的常用应用领域如下:
STR 在人类基因组中广泛分布,与传统的蛋白质遗传标记如红细胞抗原、同工酶标记、 血清蛋白标记及人类白细胞抗原蛋白相比,其等位基因多、杂合度高,因此当多个 STR 基 因座被联合检测时,个体识别概率和非父排除率很高。在 Did 等人研究的 5264 个 STR 基因 座中 93% 的杂合度大于 0.5, 58% 的杂合度大于 0.7, 平均杂合度为 0. 7,这说明不同个体基因型不同的可能性更大,随机个体与罪犯之间的基因型相同的可能性大大减小。据研究 报道,两个无关个体在 14 个 STR 基因座基因型完全相同的可能性仅为 1X10-14,即从理论上讲,目前地球上 60 亿人口中没有任何两个无关个体的这 14 个 STR 基因座基因型完全相同。
STR 的片段较短,很容易通过 PCR 扩增、电泳分型,因此比绝大多数其它遗传标记系统更 适用于高度降解检材的检测;其中三核苷酸、四核苷酸重复的 PCR 扩增结果最稳定,产生的附 加带、影子带少,容易分离,所以 STR-PCR 在法医学中得到了最为广泛的应用。STR-PCR 技 术在检测血痕、唾液斑、精液斑、人体组织等进行个体同一认定、亲权鉴定等方面取得了显著的 成绩。对末代沙皇一家遗骨的鉴定中,英国内务部成功地利用 5 个 STR 基因座对挖掘出来的 75 年以前的尸骨进行了检测,在 DNA 含量仅为 50pg 或更少的情况下,认定了 9 副骨骼的性别及亲 属关系次,对古老(高度降解)微量检材的检测取得令人满意的结果,引起了国际社会的普遍 关注,使人们对 STR-PCR 技术在法医学鉴定中的应用充满信心°美国对博物馆中动物标本及琥 珀等样本所进行的 STR-PCR 分析,更证实了它在法医学鉴定及人类学研究中强大的鉴别 能力。
STR-PCR 的扩增效率极高,仅需要 ng 级甚至 pg 级的模板 DNA, 在这样微量的检材中由于 操作过程中少量 DNA 的污染所造成的影响将是很大的。但在沙皇遗骨检测中,为防止污染釆用 了严格的限制条件,将 DNA 提取和 PCR 扩增分别在两个实验室中完成,所有样本均采用一次性消毒塑料管,多点取样,并严格设立阳性和阴性对照,结果证明 PCR 污染基本不会影响实验结 果的准确性和可靠性。
举个应用的实例:牙齿是白骨化尸体检验中的常见检材,从牙齿中提取 DNA 并进行 STR 分型是对白骨化尸体进行尸源鉴定的重要技术手段。由于牙齿中的细胞含量相对较少, 加之受时间、环境等因素的影响,使牙齿的 DNA 提取成为法医 DNA 检验的一大难点。在实 际案件的鉴定过程中,通过对来源不同的牙齿样本预处理,使用物理及化学方法去除牙齿表 面污染物,经脱钙、裂解、纯化从牙粉中提取 DNA, 采用复合扩增 PCR,对 STR 进行分型。

来源:丁香实验团队

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