利用热激活引物进行热启动PCR实验
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简介
PCR 因具有较高的特异性和可靠性，被广泛应用于遗传检测、亲子鉴定、血液筛査、临床 诊断中，除此之外，PCR 技术也是分子生物学研究领域中非常有用的工具。但是 PCR 技术也有 一些固有的缺陷，主要表现在 PCR 实验中总是不可避免会出现一些非特异性扩增的产物。为了克服这个缺点，目前研究者多采用热启动 PCR （hot start PCR）来降低这些非特异性产 物的扩增。热启动 PCR 是一种改良的 PCR 方法，是一项非常有价值的工具，已被证明可降低靶 DNA 扩增过程中非特异条带的产生。热启动 PCR 的方法很多，目前有人介绍一种新的热启动 PCR 方法，对脱氧核糖核昔 - 5’- 三 磷酸根（dNTP）进行修饰，产生可以热激活的衍生 dNTP，将其引入到引物的 3’末端，产生了 一种新的热激活引物，从而为热启动 PCR 方法带来新的应用前景。
原理
利用热激活引物进行热启动 PCR 实验的基本原理是在 PCR 反应体系中的一种关键成分 —— 引物中引入保护性基团，利用传统的固相合成技术，4-氧-戊基（OXP）和 MAF 这两种磷酸三酯（PTE）修饰基团很容易通过一种被修饰过的亚磷酰胺试剂引入到引物中。有研究显示 OXP 基团在热启动 PCR 中具有广泛的应用前景，因为在高温条件下，OXP 保护基团更易从引物上解离，使引物很快恢复延伸活性，这种转变不需要额外的常规处理。
这种保护性基团的解离可能是由 PCR 反应缓冲液中 Tris 碱的酸化作用导致的，加热可导致 PCR 缓冲液中的 Tris 碱的 pH 值降低，例如在 25 ℃条件下，缓冲液的酸碱性（pH 值）为 8，但是当温度达到 95 ℃， pH 则变成 6。有研究者研究了 PTE 引物转化成 PDE 引物的动态效果，将 PTE 引物与 PCR 缓冲液（25 °C 条件下，pH 为 8.4）在 95 ℃条件下共同孵育，大概 40 min， OXP-引物基本上全部转化成 PDE 引物，半数转化时间被定为 8.5min ± 1.5min，含有两个 OXP 基团修饰的引物转化成相应的未修饰 PDE 引物相对来说就比较复杂，需要分两步来完成 OXP 基团的去除。在 95℃条件下，需要 1〜l.5 h 才能完成彻底转化。
来源：丁香实验团队
操作方法
PCR 因具有较高的特异性和可靠性，被广泛应用于遗传检测、亲子鉴定、血液筛査、临床 诊断中，除此之外，PCR 技术也是分子生物学研究领域中非常有用的工具。但是 PCR 技术也有 一些固有的缺陷，主要表现在 PCR 实验中总是不可避免会出现一些非特异性扩增的产物。为了克服这个缺点，目前研究者多采用热启动 PCR （hot start PCR）来降低这些非特异性产 物的扩增。热启动 PCR 是一种改良
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