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体外基因随机突变

实验分类:

DNA 实验

最新修订时间:

简介

体外基因突变技术分随机突变(random mutagenesis)和定点突变(site-directed mutagenesis)两类。随机突变常用于鉴定靶基因的某项特定功能在基因序列中所处的大致位置及其与周围序列的关系。对靶基因产物及其功能知之甚少时,可首先采用随机突变法确定其功能区域。目前,体外基因随机突变常用化学诱变法(chemical mutagenesis)易错 PCR (error-prone PCR)产生随机突变体。


原理

体外基因随机突变技术包括化学诱变法易错 PCR 法。
化学诱变法的基本原理是将 DNA 片段暴露于化学诱变剂如亚硝酸、羟胺、亚硫酸氢盐或肼,然后将 DNA 片段克隆形成一个小的文库,再用适当的方法进行各个克隆的表型鉴定以及进一步的序列分析,以确定突变与表型之间的关系。化学诱变法虽然简单、经济,但也存在明显不足,如突变率难以控制、回收效率较低,且大多数诱变剂发挥作用时具有碱基特异性,在诱变的过程中还会产生大量的无用突变等。
易错PCR的基本原理是通过改变传统 PCR 反应体系中的 Mg2+ 浓度、dNTP 的浓度比例、pH,或使用低保真度的 Taq DNA 聚合酶,在 DNA 序列扩增中随机引入错误碱基,建立含突变序列的文库。


应用

随机突变常用于鉴定靶基因的某项特定功能在基因序列中所处的大致位置及其与周围序列的关系。对靶基因产物及其功能知之甚少时,可首先采用随机突变法确定其功能区域。


来源:《医学分子生物学实验技术》药立波第3版第5章

操作方法

基于化学诱变法产生随机突变体

化学诱变法(chemical mutagenesis)是将 DNA 片段暴露于化学诱变剂如亚硝酸、羟胺、亚硫酸氢盐或阱,然后将 DNA 片段克隆形成一个小的文库,再用适当的方法进行各个克隆的表型鉴定以及进一步的序列分析,以确定突变与表型之间的关系。有多种化学诱变剂可用于产生随机突变。如甲基磺酸乙酯(ethyl ethanesulfonale, EMS)可以使 DNA 链上的碱基发生烷基化,造成DN

基于易错 PCR 产生随机突变体

易错 PCR (error-prone PCR ) 是产生随机突变体的另一常用方法,通过改变传统 PCR 反应体系中的 Mg2+ 浓度、dNTP 的浓度比例、pH,或使用低保真度的 Taq DNA 聚合酶,在 DNA 序列扩增中随机引入错误碱基,建立含突变序列的文库。是目前最常用的随机突变方法。原理易错 PCR 法的基本原理是通常采用缺乏 3'→5 ' 外切核酸酶活性的低保真 DNA 聚合酶扩增基

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