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双萤光素酶实验
最新修订时间：
简介
构建荧光素酶质粒，然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变。
原理
将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控luciferase的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，即双荧光报告系统。
应用
基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域
来源：丁香实验
操作方法
1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。2、转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。Luciferase活性测定：⑴ 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解
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