DNA 测序

实验分类：

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

DNA测序可用于：（1）测定未知序列；（2）确定重组DNA的方向与结构；（3）对突变进行定位和鉴定比较研究。

来源：丁香实验

操作方法

自动测序法

一、准备工作 1. BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。 2. pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2 g/L，试剂盒配套试剂。 3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 umol/L，即3

双脱氧链末端终止法

一、试剂与器材准备 1. 试剂（1）退火缓冲液：1 mol/L Tri-HCl(pH7.6)，l00 mmol/L MgCl2 和160 mmol/L DTT。（2）通用测序引物：5'-d[CGTAAAACGACGGCCAGT]-3'，在水溶液中(5 pmol/ul)。（3）T7DNA聚合酶(8 ug/ul)：在加有甘油的缓冲液中,应储于-20℃，用时吸取1份后迅速放回。

非同位素银染

一、试剂准备 1. SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。 2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V）：95 g丙烯酰胺，5 g甲叉双丙烯酰胺溶于140 ml 双蒸水中，定容至250 ml，0.45 mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。 3. 10%过硫酸铵，0.5 g过硫酸铵溶于4 ml水中，

鸟枪法

一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，并用Agarose凝胶电泳进行回收。二、对回收的大片段DNA用物理方法（如超声波等）进行切断处理，然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。三、进行Agarose电泳，切胶回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。

Maxam-Gilbert化学修饰法

一、取待测DNA片段，既可以是单链也可以是双链。此法又叫化学切割法，或化学降解法，切割之前先对待测片段作末端标记。用放射性P32-磷酸集团标记链的末端之一。二、将标记完的样品，分成四份。分别采用不同的化学试剂对所得样品，进行修饰进而切割（切割就是利用特异的化学试剂，修饰DNA分子中不同的碱基，使被修饰的碱基之间的连接变得不稳定，发生断裂，而产生各种长度的DNA片段。）