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科研学霸天团，48小时有问必答

问消化的染色质浓度过低怎么处理？

丁香实验

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg，然后继续实验。②在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量，在声波处理前后在显微镜下观察胞核，以证实胞核完全裂解。

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问为什么我的ChIP实验做出来，结果就是不理想呢？为得到理想的ChIP结果，怎么优化实验条件？

丁香实验

1、染色质的制备：为了获得足量的染色质，我们的样品准备一定要充足。（IP实验的损耗较大，为保证实验用量，一次准备5×10E7个以上细胞较好）2、优化交联固定条件：ChIP实验成功与否，直接取决于染色质完整性、抗原表位质量和抗体特异性（抗体一定买好的）。因此优化交联固定条件，富集丰度更高。3、优化染色质片段化条件：要得到理想的ChIP结果，合适长度和浓度的染色质样品至关重要。（推荐的片段化程度

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问免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。

丁香实验

关于抗原修复，我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是

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问DNA、mRNA和蛋白质–这是一个悲伤的故事

7月未央

哭着哭着，蛋白就水解了。（= =|||||||||||||||||）DNA终于又转录了一个mRNA。DNA说：“你好，我是你的模板。”mRNA说：“你好，我是mRNA。”DNA仔细地看着mRNA：“你和他，真是一模一样。”mRNA：“谁？”DNA：“我上一次转录的mRNA。”停了停，又说：“你们明明是一样的，为什么我还在想念他呢？”说完，DNA慢慢合上了眼睛（…）。如果相遇的尽头注定是错过，是不是

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问DNA的分子量估算

ajun333333

核酸、核苷酸的基本换算1．核酸的换算：(1)摩尔数与质量：1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28

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问冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？

丁香实验

1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用

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问一抗孵育的条件和浓度如何摸索？

丁香实验

1、孵育条件选择：根据大量外文文献参考，4度过夜的最多，37度或直接室温的较少。故可以按照4度过夜+室温或37度复温（增进抗体抗原结合和防止脱片）。2、组织切片的选择：仅选择某一组同一只动物标本，这样才有可比性，且最好是预想肯定阳性的组别中的动物切片。3、一抗浓度摸索：主要参照说明书推荐的浓度，并结合文献中对于某种组织的大概浓度范围，同时也要考虑不同公司之间同一抗体的浓度和效价的不同。从最高浓度向

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问如何避免荧光素提前衰退？

丁香实验

1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；2、选择质量好的荧光素标记的二抗：亲和力强且衰退时间延长；3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；4、拍照时尽量缩短激发光对切片的照射时间，最好在暗场环境；5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。6、荧光素标记的二抗浓缩液一定要避光保存：没加石蜡，最后-70度以下低温保存；若加了石蜡油，则-20度保存即可。

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问如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？

丁香实验

产生原因：（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分

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问组织免疫荧光染色必需用Triton吗

丁香实验

用丙酮固定细胞或是冰冻切片可以不许要破膜。丙酮本身就有改变细胞通透性和使蛋白沉淀的作用。——要看你做的蛋白存在于胞内还是胞外。胞外，一般是胞膜上的，可以不用Triton。胞内的，包括胞质内，胞核内的，那就得用了，不用的话，染到的阳性细胞只是其中的一部分。

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问切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？

丁香实验

a.也许是抗体本身有问题，因为有很多公司的抗体质量并不好，很容易上背景，可以换一种抗体试试。b.如果经费不允许换抗体的话，你可降低抗体的浓度，并随时注意观察显色，在能看到信号的情况下尽量降低背景。c.可以换一种封闭液，不同的封闭液对某种来源的抗体来说，会有不同的封闭效果。d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清，这样可以去除一部分非特异性染色。

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问免疫组化结果老是出现阴性结果？

丁香实验

免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号，也有可能是抗体出了问题。你可以找一些阳性组织做一下，以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有，你可以提高抗体的浓度，或者试一试抗原修复等方法，也许会得到意想不到的结果。

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问内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

丁香实验

（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.（3）现用现配，配好后4度避光保存。

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问在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？

丁香实验

（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修复，我们一般用6miundefined4次，效果不错。

1 回答183 围观

问DAB显色时间如何把握？

丁香实验

（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能

1 回答158 围观

问中杉金桥的二步法免疫组化试剂盒要不要加封闭？液

boborsky

两步法不用加吧，我是用的dako的envision两步法，不用加血清封闭的。

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问石蜡切片免疫组化实验做不出结果是为什么？

苹果嘿嘿

最好把试剂和实验流程都列出来只这样说太笼统了

7 回答2236 围观

问没有用盐酸分化有什么影响啊？

diudiu2006

盐酸分化只是将残留在胞质中苏木精洗掉，使胞质胞核的界限更加明显。与DAB上色没有关系。怀疑你的DAB显色没有成功。

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问免疫组化一抗的选择要点和技巧是什么？

xtt123

要点：一抗二抗都是一种可以特异结合别的东西的基团，而且一抗可以至少结合两种其他基团（底物和二抗）

5 回答3408 围观

问组织切片做免疫荧光，背景色太重怎么办？

shy890726

背景色成因分两方面一、组织切片因染色过程或组织非特异荧光而出现的背景色二、拍照时因硬件设施或取景器设置而出现的背景色。针对第一种问题有以下几点建议：1. 采用高品质的多聚甲醛固定减少普通甲醛的自发萤光 2. 切片厚度减薄 3. 切片贴片后流水冲洗干净减少杂质荧光 4. 一抗以及二抗漂洗干净！（非常重要） 5. 选用高品质封片介质。针对第二种问题有以下几点建议：1. 曝光时间的控制 2. 暗室操

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