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科研学霸天团，48小时有问必答

问做小鼠脾脏的胞内因子分析时，应该用什么刺激阻断剂，适合与IL-6和IL-1β的检测？

府宅

可通过收获3天巯基乙酸盐诱发的腹膜细胞，并用1μg/ ml LPS和GolgiPlugTM刺激4小时

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问请问做肿瘤的免疫组化实验，需要阳性、阴性对照吗？

小布丁瑶瑶

免疫组化阴性对照一般是需要做的，但是也不是每一种检查都需要做阴性对照的，如果检查不常用的抗体就需要做阴性的对照，如果是常用的抗体就不需要做阴性对照了，只需要做阳性对照就可以了。

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问爬山细胞怎么做免疫组化，HE染色技术，详细步骤，谢谢师兄师姐。

dxy_gwrp7ndq

HE染色：（1）先将长有细胞的六孔板用PBS洗3次（2）将六孔板浸入95％的酒精固定15分钟（3）PBS洗2次，每次1分钟（4）浸入苏木素染液，染色5分钟（5）自来水浸洗（6）浸入稀盐酸酒精进行分色，数秒即可（7）自来水浸洗（8）浸入淡氨水中，使胞核蓝化，3分钟（9）自来水浸洗（10）浸入伊红染液，染色6分钟（11）自来水浸洗（12）依次经过70％、80％、90％酒精各1次，95％酒精2次和100

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问请问Elisa的试剂为什么必须先在室温平衡，目的和原理是什么

yfcwyh

在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA试剂盒测定中试剂的准备zui为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地

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问请问用CD24-FITC CD44-APC标记肿瘤干细胞用流式检测的时候群体会移动是怎么回事啊，同一个样品先后两次上样群体

Timy最爱柠檬水

如果一批细胞需要重复多次流式检测，最好使用多聚甲醛进行固定，这样才能排除细胞因离体后出现再分化的情况。与此同时，应该在再次检测的时候重新调整电压。

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问免疫组化过程中要注意哪些问题？如何确定抗体的滴度？

小暮

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问流式细胞术巨噬细胞分析

txs900416

一般巨噬细胞流式需要封闭，封闭得好的话是只有一群的，固有层巨噬细胞应该是f4/80阳性，建议楼主封闭完全+染cd11b，可看到双阳的就是巨噬细胞。如果出现中表达和高表达，建议在确定没有非特异性染色的情况下，两群都圈进去

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问请问用断颈法处死符合伦理吗？按这种方法做实验投稿会有影响吗？

txs900416

符合伦理，但要在中度麻醉下进行断颈，不能直接断颈，伦理过不了

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问在免疫组织化学的染色过程中，脱片产生的原因和如何防止脱片？

郭郭的郭郭

1.多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。2.组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切得厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3.组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。4.没烤好，时间短温度不够之类。

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问在免疫组织化学的染色过程中，常用试剂的配制和使用？

dxywode

先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB 溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB 终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为 0.01%。

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问 PBS 的 pH 和离子强度的使用和要求？

LLLLDL

中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。

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问放射免疫测定时，胰岛素释放试验的曲线特点？

LLLLDL

（1）胰岛素分泌不足型：为试验曲线呈低水平状态，表示胰岛功能衰竭或遭到严重破坏，说明胰岛素分泌绝对不足，见于胰岛素依赖型糖尿病，需终身胰岛素治疗。（2）胰岛素分泌增多型：患者空腹胰岛素水平正常或高于正常，刺激后曲线上升迟缓，高峰在2小时或3小时，多数在2小时达到高峰，其峰值明显高于正常值，提示胰岛素分泌相对不足，多见于非胰岛素依赖型肥胖者。该型患者经严格控制饮食、增加运动、减轻体重或服用降血糖药物

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问双向免疫扩散实验怎么判断抗原蛋白相对浓度？

LLLLDL

当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据有否出现沉淀线，可用已知的抗体鉴定未知的抗原，或用已知的抗原鉴定未知的抗体。沉淀线靠近抗原孔，则提示抗体含量大；靠近抗体孔，则提示抗原含量较多；不出现沉淀线则表明抗体或抗原的缺乏或抗原过剩；另外，如出现多条沉淀线,则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，可用于鉴定抗原或抗体的纯度。

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问免疫荧光染色实验中，有时用甲醛进行固定时间较长可以得到更好的染色，有时较短染色效果更好，请问固定时间与蛋白质种类是否存在联系？

txs900416

取决于目的蛋白的性质，有时候固定时间太长，细胞膜表面分子容易变性脱落；有时候固定时间太短，固定不完全，染色效果不好

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问免疫荧光共定位量化一般采用哪个系数？

简单最重要666

皮尔逊相关系数和及重叠系数。两者作用关系仍然有所不同

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问染色细胞质不清晰的原因是什么？

颜渊溪桥

如果你说的是荧光染色，除了实验操作外，一个可能是抗体特异性不够，另一个可能是细胞比较圆，不是很适合做染色观察，实验目的允许的情况下可以换成比较铺展的细胞做。

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问怎样减少非特意结合？抗体已定

今天摆烂了咩

抗体浓度过高也可能导致此问题降低抗体浓度，可以减少非特异性条带

3 回答58 围观

问所有底物在孵育之前都要避光吗？

yfcwyh

ELISA实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹，或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。

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问需要自己制备特异性抗体吗，得到抗体之后再怎么操作呢

小暮

一般自己做课题制备不了特异性抗体吧，特异性抗体不都是买文献介绍的吗？至于得到抗体后怎么操作看你要做什么实验吧，WB？ELASA？CHIP？都是看抗原和特异性抗体结合

1 回答107 围观

问一抗过程中无法足够一和目标蛋白结合 ? 细胞核显色不明显，靶细胞中没有目标蛋白? 切片本身脱蜡不彻底，如何解决?

郭郭的郭郭

1、洗涤不充分，膜没有洗干净。2、封闭不充分，一抗可能直接结合到膜上，造成二抗孵育时在非特异性位点发生结合。3、一抗/二抗浓度太高，出现非特异性结合。要解决封闭不充分这个问题，可尝试延长封闭时间，也可更换封闭液。常用的封闭剂有 5% 脱脂奶粉、5% BSA、血清和明胶等，推荐室温封闭 1 小时以减少背景。另外，脱脂奶粉常含有酪蛋白，由于酪蛋白会结合磷酸化抗体而易产生高背景。因此，检测磷酸化蛋白时建

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