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原来可以表达的蛋白现在诱导表达不出来了,请问有没有同学遇到相似的问题,最后怎么解决的?感谢!

相关实验:蛋白表达体系构建

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喜欢吃蛋糕

以前的重组菌表达很好,现在重新提质粒转BL21(DE3)后没有表达。质粒酶切鉴定是正确的。

1.IPTG做过阳性和阴性对照,结果正常。

 

2.感受态细胞也做过阳性对照,正常。

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8 个回答

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dxy_s0493x6r

有帮助

试试保存甘油菌时加入葡萄糖,取甘油菌培养时也加葡萄糖,转接之后不要加糖。我之前也遇到过类似的问题,这样做就稳定表达了

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喜欢吃蛋糕user-title

你好,请问需要加多少浓度的葡萄糖呀?

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dxy_9f7mnbp2

有帮助

楼主解决了么,最近做实验遇到了相同的问题

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dxy_yosbt86

有帮助

质粒保存没问题的话就重复做几次感受态吧,反正我会在转化之后做菌p去check有没有导入,另外最好诱导做一下浓度或者时间的梯度试一下

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dxy_1t4qso5q

有帮助

请问题主解决了么,我也遇到了一模一样的问题,半个月前诱导出来了,但是最近,诱导时间和诱导温度一模一样,操作也一样,都诱导不出来

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yedan1

有帮助

请问题主解决了这个问题了吗?我也遇到同样的问题

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喜欢吃蛋糕user-title

还没有,能想到的影响因素都试过了,还没找到目标蛋白。测序酶切都没问题,还在想办法中。你有没有什么好的建议,可以一起交流交流。

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huarenqiang5

有帮助

考虑可能是如温度过高或过低、培养时间太短或太长,或者诱导剂的浓度不够或质粒发生污染导致。

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喜欢吃蛋糕user-title

非常感谢你的回复!就是之前成功表达出来了,在上清里还挺明显的,在原来操作条件的基础上,时间或者温度有略微的差异,会导致一点蛋白都看不到吗?我蛋白做的比较少,经验不太够。

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高山云初

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两方面原因:

1.表达条件不优

蛋白质的诱导表达通常需要适宜的温度、培养时间、诱导剂浓度等条件,这些条件可能会因不同蛋白而不同。如温度过高或过低、培养时间太短或太长,或者诱导剂的浓度不够,都可能导致蛋白质无法被充分表达,从而无法诱导出来。

2.质粒或表达宿主株问题

质粒或表达宿主株问题也可能导致蛋白质不容易诱导出来。比如,质粒本身可能受到污染或损伤,导致表达蛋白的缺陷;表达宿主株则可能存在蛋白降解酶、异物毒性等问题,导致蛋白质无法得到稳定的表达。

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喜欢吃蛋糕user-title

非常感谢你的回复,列举的可能影响因素非常全面。我是去年九月份用BL21和Rosetta各表达过一次,当时检测的时候是在上清里,很明显。今年想放大那两个蛋白,就先小试了一下。将之前保存的质粒重新导BL21,挑单克隆,酶切验证正确,发酵诱导蛋白表达,发现没有表达。IPTG和BL21理论上应该没有问题,因为同时表达了其他蛋白,有成功表达出来。操作和之前可能有略微差别,大体一致,我想的是如果是操作问题或者表达量变低或者条件没有优化等,它应该会表达出少量吧,不至于一点都看不见。操作差异较大的是这一次在超声破碎之前加了溶菌酶,不知道是不是这个原因。我明天会重新再做一次,如果还是没表达的话,请问还能从什么方向去考虑?在网上看到一个帖子,和我遇到的问题一样,可惜年代太久,联系不上题主了。

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周末也要努力呀

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注意处理因素作用的时间,温度等是否与之前一致,也要注意诱导剂是否已经失活

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喜欢吃蛋糕user-title

非常感谢你的回复!诱导剂应该没问题,因为同时做了其他实验。操作如果有略微差异的话会导致一点蛋白都看不到吗?因为去年表达的时候在上清里还挺明显的。

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