原来可以表达的蛋白现在诱导表达不出来了，请问有没有同学遇到相似的问题，最后怎么解决的？感谢！
喜欢吃蛋糕
以前的重组菌表达很好，现在重新提质粒转BL21（DE3）后没有表达。质粒酶切鉴定是正确的。
1.IPTG做过阳性和阴性对照，结果正常。
2.感受态细胞也做过阳性对照，正常。
9 个回答
dxy_2h2nni9
楼主解决了吗，我也遇到了相同的问题
dxy_s0493x6r
试试保存甘油菌时加入葡萄糖，取甘油菌培养时也加葡萄糖，转接之后不要加糖。我之前也遇到过类似的问题，这样做就稳定表达了
喜欢吃蛋糕
你好，请问需要加多少浓度的葡萄糖呀？
dxy_9f7mnbp2
楼主解决了么，最近做实验遇到了相同的问题
dxy_yosbt86
质粒保存没问题的话就重复做几次感受态吧，反正我会在转化之后做菌p去check有没有导入，另外最好诱导做一下浓度或者时间的梯度试一下
dxy_1t4qso5q
请问题主解决了么，我也遇到了一模一样的问题，半个月前诱导出来了，但是最近，诱导时间和诱导温度一模一样，操作也一样，都诱导不出来
yedan1
请问题主解决了这个问题了吗？我也遇到同样的问题
喜欢吃蛋糕
还没有，能想到的影响因素都试过了，还没找到目标蛋白。测序酶切都没问题，还在想办法中。你有没有什么好的建议，可以一起交流交流。
huarenqiang5
考虑可能是如温度过高或过低、培养时间太短或太长，或者诱导剂的浓度不够或质粒发生污染导致。
喜欢吃蛋糕
非常感谢你的回复！就是之前成功表达出来了，在上清里还挺明显的，在原来操作条件的基础上，时间或者温度有略微的差异，会导致一点蛋白都看不到吗？我蛋白做的比较少，经验不太够。
高山云初
两方面原因：
1.表达条件不优
蛋白质的诱导表达通常需要适宜的温度、培养时间、诱导剂浓度等条件,这些条件可能会因不同蛋白而不同。如温度过高或过低、培养时间太短或太长,或者诱导剂的浓度不够,都可能导致蛋白质无法被充分表达,从而无法诱导出来。
2.质粒或表达宿主株问题
质粒或表达宿主株问题也可能导致蛋白质不容易诱导出来。比如,质粒本身可能受到污染或损伤,导致表达蛋白的缺陷;表达宿主株则可能存在蛋白降解酶、异物毒性等问题,导致蛋白质无法得到稳定的表达。
喜欢吃蛋糕
非常感谢你的回复，列举的可能影响因素非常全面。我是去年九月份用BL21和Rosetta各表达过一次，当时检测的时候是在上清里，很明显。今年想放大那两个蛋白，就先小试了一下。将之前保存的质粒重新导BL21，挑单克隆，酶切验证正确，发酵诱导蛋白表达，发现没有表达。IPTG和BL21理论上应该没有问题，因为同时表达了其他蛋白，有成功表达出来。操作和之前可能有略微差别，大体一致，我想的是如果是操作问题或者表达量变低或者条件没有优化等，它应该会表达出少量吧，不至于一点都看不见。操作差异较大的是这一次在超声破碎之前加了溶菌酶，不知道是不是这个原因。我明天会重新再做一次，如果还是没表达的话，请问还能从什么方向去考虑?在网上看到一个帖子，和我遇到的问题一样，可惜年代太久，联系不上题主了。
周末也要努力呀
注意处理因素作用的时间，温度等是否与之前一致，也要注意诱导剂是否已经失活
喜欢吃蛋糕
非常感谢你的回复！诱导剂应该没问题，因为同时做了其他实验。操作如果有略微差异的话会导致一点蛋白都看不到吗？因为去年表达的时候在上清里还挺明显的。
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