请问elisa实验中，空白、阳性对照、阴性对照均显色，可能是什么原因？

钟情紫丁香

2021-11-05

想要利用生物素亲和素系统、通过间接elisa和双抗原加心elisa，检测样本中的抗体。使用了间接elisa试剂盒中的抗原包被板，索莱宝的生物素标记羊抗人IgG，自制NHS-biotin标记的羊抗人IgG，自制NHS-Biotin标记的抗原，索莱宝链霉亲和素标记HRP，其他试剂均使用试剂盒中自带的试剂，包括样本稀释液、洗涤剂、显色剂、终止剂等。结果如下，我想请问，为什么会产生这样的结果，为什么自制的试剂空白孔、阳性对照孔、阴性对照孔均显色，我知道当然是自制的试剂肯定有问题，但是如果是没有标记好，应该不显色才对呀，怎么会都显色呢，除了自制的试剂其他都是用商品化的试剂，洗板也是用的洗板机，问题出在哪里呢？生物素标记物的制备：抗原或抗体200μL即1mg（母液为PBS），200μL 即2mg B-NHS（溶于DMSO），混匀，置于冰盒中反应2 h；置于室温下反应0.5 h；置于0.05 M CB中透析。加入等体积甘油（即400μL），分装，-20°C避光保存。

6 个回答

sfnana

2021-11-05

有帮助

您好，楼主，请问你的问题解决了吗？我现在也是出现了跟你一样的问题，阴性，空白值都很高。（我做的是双抗体夹心，biotin标记的抗体 1：1000 100uL/孔，亲和素1：5000）样本（O.D.450 nm）阴性（O.D.450 nm）空白（O.D.450 nm） 2.5310 0.5880 0.5415

yangguuang

2021-11-05

有帮助

很明显问题出现在你的自制的NHS-Biotin欧联的抗体和抗原上，因为使用索莱宝的试剂盒生物素标记羊抗人IgG，阴性对照和空白对照都可以的，而自制的就是行，说明你的自制的欧联物可能会与索莱宝试剂盒的预包被板有非特异的吸附，如果洗板洗不下来，就会产生假阳性的OD值，所以你要确定你自制的欧联物是否可以使用于该试剂盒，如果不能使用的话，你要换其他试剂盒或者，重新欧联了