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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
各位前辈,WB蛋白定量怎样缩短时间呀?我总是1个多小时,太耗时间。
天一湖医者
蛋白定量法开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定量至少有 5 种方法: BCA,Bradford,双缩脲法(Biuret 法),Folin 法(Lowry 法)和紫外分光光度计法。BCA 法的原理是在碱性条件下,氨基酸将二价铜还原为一价铜与 BCA 形成紫颜色的络合物,测定 562 nm 的 OD 值,所以如果样本里有还原剂(比如 DTT)的话就会对 BCA 的结果产生干扰。Bradford
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问
一个新蛋白,制备多克隆抗体时,抗原设计表达重组蛋白选择的氨基酸序列原则是什么?
vae1476
分析蛋白性质性质和特点,根据实际应用目的制定抗体,有以下原则:1)基本性质分析:查看蛋白质修饰情况(糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等)、结构域特点、剪切加工等情况,如果蛋白质有后加工,应该尽可能选择一个完整“成熟体”区段进行分析。常用网站:(Http://www.uniprot.org)。2)分析跨膜区分析:进行跨膜分析最常用的网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/T
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问
WB条带模糊,有很大的阴影盖住条带,什么原因?
迟C迟
是出现非均一性背景吗?可能是你的膜曾经干过,在每一步操作过程中,都需要注意不让膜干。
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问
如何提高筛选出标记蛋白
小刘小刘世界一流FVJ4
这个问题信息量太少了,你如果已经标记好了,还是荧光标记,那就去看荧光,如果想得到这个纯化蛋白,那就去层析,
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问
请问有做磷酸化的蛋白,造模时间不同,做出来结果完全相反的吗?
whilt-shirt
首先得确定造模是成功的,建议重复试试
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问
如何确定WB结果中目的蛋白位置高于预测位置的原因
whilt-shirt
可以通过更换不同的marker来确定
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问
银染和WB哪个灵敏度更高?
迟C迟
银染的灵敏度高,但是有时候操作不好胶就变成大花脸了。
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问
想请问一下大家,检测磷酸化蛋白表达量变化的WB实验,除了加磷酸酶抑制剂之外,怎么操作可以让磷酸化蛋白更好跑出来呢?
Kimser
因为磷酸化是个可逆过程,所以除了磷酸酶抑制剂,还需要跟时间赛跑,新鲜和短时间流畅的操作会减少磷酸化的变化。当然,抑制剂仍然是关键所在,不过要注意对不同蛋白,磷酸酶抑制剂也不同。
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问
WB条带周围总是黑黑的一团,不知道怎么回事
未来9
可能的原因①膜封闭不够,建议延长封闭的时间;选择合适的封闭液。②一抗稀释度不适宜,太高,选择最适宜的抗体稀释度。③ 一抗孵育的温度偏高,建议4℃过夜孵育。④选择的膜容易产生高背景,一般NC膜的背景会比PVDF膜低,但是NC膜吸附力也就差了一点。⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过,实验过程中要注意保持膜的湿润,使用镊子夹取膜。⑥检测时曝光时间过长,可减少曝光时间。
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问
为什么WB条带一个位置总是有两条,只敷了一种蛋白?
whilt-shirt
可能是抗体的特异性不好,也有可能是抗体浓度过高
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问
跑出来的带总是弯弯曲曲的怎么处理?
bamboopiggy
灌胶匀一些,或者低电压跑慢点,或者用软件拉直。
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问
跑出来的带总是很弯曲是哪里出了问题?
whilt-shirt
配胶没混匀,或者电泳液有问题。
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问
请问,敷抗低温过夜和常温2h,效果差别大吗?
天一湖医者
差别很大的,建议低温过夜,常温2小时有有可能会不显!
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问
请问大分子目的蛋白,本底表达低,每次跑出来都只能看见maker,目的条带都很若,有什么解决的办法嘛?
迟C迟
推荐使用Tris-Acetate 凝胶跑大分子蛋白,会呈现更高的分辨率。凝胶浓度与孔径成反比,即凝胶浓度越小,孔越大,较大分子量的蛋白质更容易通过,所以建议使用6-8%浓度的分离胶,当然也可以使用梯度凝胶。
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问
植物总蛋白提取相关,请问怎么提取植物总蛋白效率高,如何能western时不反白
bamboopiggy
你wb反白,就是因为你蛋白浓度高了,最好降低上样浓度试试。因为蛋白浓度高,辣根过氧化物酶反应剧烈,在你来不及显影之前,就把发光底物消耗光了,反而不能发光了。
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问
WB条带白色背景黑色是什么原因?
dxy_yjs8h877
很多时候是因为封闭的不好,或者洗膜洗的不干净的原因导致的。
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问
跑蛋白胶的maker用多少合适呢?
dxy_yjs8h877
一般为了节省都用5ul左右就够了,怕不好点样的话可以适当稀释一下然后加大用量也可以。
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问
两块胶一起转膜,为什么一个成功一个失败?
天一湖医者
考虑到会不会是封闭时间不足或者膜有没有出现干了的现象。
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问
做WB的时候用商品化封闭液封闭结束是否需要用TBST洗脱后再加一抗孵育?用脱脂奶粉的时候是洗脱的,不知道这种成品是否仍需要?
vae1476
每个商品化封闭液都有自己的Protocol,所以要按照说明书来做,其优点是封闭时间很快。
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问
如何稀释已经加入5xloading的蛋白质,如果用1xloading的话,那怎么用那种试剂把5x稀释成1x的
天一湖医者
加入蒸馏水就可以,或者用原缓冲液稀释!
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