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科研学霸天团，48小时有问必答

问PCR结果怎么看？如何区分真假阳？

dxy_oeu11rar

通过琼脂糖凝胶电泳可以看到pcr结果，设置阴阳对照可以区分真假阳性，通常情况下阴性对照设置成水对照，即体系中不加入DNA模板，如果阴性对照无条带，结果更加可信

7 回答301 围观

问如何用购买的阳性质粒制作转基因含量0.01%的阳性样品？例如：已知一个35s质粒，86bp，5微克，干粉。

bamboopiggy

可以参考一下这个专利：https://patents.google.com/patent/CN1718743A/zh本发明公开了一种转基因烟草检测方法，包括(一)巢式PCR定性检测：获得可用于PCR反应的样本DNA，同时检测样本的花椰菜花叶病毒启动子调控序列CaMV 35s、根癌农杆菌终止子调控序列nos和抗卡那霉素选择标记基因序列NPT II，引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1至SE

3 回答83 围观

问为什么有一个基因，换了好几个高保真酶，也用了二步PCR（先45℃退火10个循环，再55℃退火25个循环）还是完全没有条带呀

whilt-shirt

有可能是引物问题，建议重新设计引物

4 回答127 围观

问为什么我用QPCR测端粒长度时阴性对照总是出现CT值？而且该CT值和加DNA后的CT相差并不大？

天一湖医者

主要看你的CT值大约是多少，如果很大（大于40循环）那么可以判定结果没有问题，如果跟目的基因的CT一致或者为其他CT值那么判断为模板造成的气溶胶污染或者其他外缘DNA造成的污染。另外你阴性对照加的是水，那么说明你做梯度稀释的时候用的也是灭菌水，这个做荧光定量试验是很不规范的，建议用专门的荧光定量稀释液去做。

3 回答101 围观

问可以通过测反转录产物浓度判定反转效率吗？

bamboopiggy

反转的效率一般是通过RT-pcr的方法进行检测的，没人用cDNA的浓度来确定。

6 回答142 围观

问PCR中的CT值问题

balalaLy

逆转录酶反复冻融或者使用过程中没有确保在冰上进行会使酶活性降低，内参的CT值会升高，导致实验结果出现相反的方向。

4 回答158 围观

问求助各位老师，我刚开始学习引物设计，在NCBI里搜乳酸杆菌的基因序列，结果有几万条，需要全部粘贴在Prim

汤姆卜丽波

不用全贴看有认证的，然后选择一个，只贴你需要的就可以了

4 回答231 围观

问求助：od为2的引物稀释方法？

未来9

1nmol用10ul ddh2o稀释，浓度为100um,此浓度为储藏浓度，工作浓度要稀释到10um.订引物时候，填10nmol就可以了，不用管 od

3 回答159 围观

问PCR试验中双链互补的问题？

bamboopiggy

在CpG岛两端设计引物进行PCR，pcr过程中，随着pcr引物的延申，T的互补生成A，C的互补生成G，不会不互补

3 回答184 围观

问用质粒克隆某一DN片段，我我不明白，两端是如何终止的？

bamboopiggy

终止于您的primer binding的位置，没有引物结合，就无法扩增。

2 回答69 围观

问用BioRad跑RT-PCR，不同的SYBR跑出来的GAPDH会有很大差别么，一个15+一个18+，但是样品差不多，选择哪个

whilt-shirt

可能是试剂的稳定性不太好，建议重新跑一板

3 回答95 围观

问定量PCR中两步法跟三步法有啥区别？对结果影响大吗？

bamboopiggy

对定量pcr来说：因为产物是短片段，用两步法或三步法影响不大。两步法即循环扩增中设置2个步骤，一个是95度变性，另一个是退火与扩增的温度，一般设置在55~60之间，主要用于扩增短片断，节省时间。三步法就是平常见到的方法，扩增分三步，变性，退火，延伸。时间稍长。

3 回答3769 围观

问双标记探针QPCR问题

dxywode

出现非特异扩增或引物二聚体：反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差，可能导致出现抑制 PCR 反应的现象。在绝对定量时表现扩增效率大于110%。解决方案：去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线；对目的基因做标准曲线，一般用质粒做梯度稀释，或用 PCR 产物做梯度稀释，然后做定量扩增，通过曲线评估反应效率。绝对定量有效的扩增效率在 90%-110%；重新纯化模板，去除模板中存在的潜在抑制物。

3 回答131 围观

问逆转录PCR实验中，逆转录后，一般取多少的cDNA进行后继的PCR圹增？

迟C迟

我们实验室是逆转录之前控制逆转录的量，然后PCR体系中模板量用4微升，一般不超过体系的10%。

4 回答272 围观

问PCR结果CT值多少比较适合

迟C迟

Actin的CT值一般会小一点，20左右。目的基因看表达，一般低于37/38都还能用，太低可以稀释样本。

4 回答551 围观

问请问qpcr和pcr本质的区别是什么？怎样诊断呢？

迟C迟

qPCR是荧光定量PCR，相比普通PCR，会加入染料，便于收集荧光信号。结果可以得出相对/绝对浓度等多组数据，然后根据你的目的，对实际数据进行分析。还能通过ntc的ct值判断实验合不合格。一般需要单独的仪器，像Roche 480。

3 回答240 围观

问怎样解决PCR复合扩增中的扩增不平衡的问题？

dxywode

通过向原有PCR反应体系中加入PCR添加剂，来降低双螺旋DNA的稳定性，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR反应体系为所述对待测等位基因进行PCR扩增出现等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR反应体系。实验证明，该方法确实可以有效的解决由于“部分待测等位基因在PCR扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和DNA双链解链不充分”而导致的等位基因扩增不平衡。

3 回答242 围观

问逆转录的CDNA要测浓度吗

bamboopiggy

一般没有人去测cDNA的浓度，因为你同一批rna调整浓度后，同一批次做的反转录认为反转效率是一致的，并且跑realtime以后，可以用内参来继续调整。

4 回答2055 围观

问内参的扩增曲线没有平台期，FAM通道没有问题，这个结果是否可以采用？

bamboopiggy

做realtime一般 pcr的cycle是40，你设置的太少了。还是改一下，用40个cycle，然后看CT值吧

3 回答121 围观

问多重PCR怎么优化，有什么好用的软件吗？

bamboopiggy

我喜欢用neb的Golden Gate 克隆组装设计软件 NEB Golden Gate Assembly Tool，其实用哪个都差不多，你只是要平衡一下退火温度。

3 回答228 围观

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